Bruke E1A Minigene Tool til å studere mRNA-skjøteendringer
Summary
Denne protokollen presenterer et raskt og nyttig verktøy for å evaluere rollen til et protein med ukarakterisert funksjon i alternativ skjøteregulering etter kjemoterapeutisk behandling.
Abstract
mRNA-behandling innebærer flere samtidige trinn for å forberede mRNA for oversettelse, for eksempel 5’capping, poly-A addisjon og skjøting. Foruten konstituerende skjøting, tillater alternativ mRNA-skjøting uttrykket av multifunksjonelle proteiner fra ett gen. Siden interaktivitetsstudier generelt er den første analysen for nye eller ukjente proteiner, er foreningen av agnproteinet med skjøtefaktorer en indikasjon på at det kan delta i mRNA-skjøteprosessen, men å bestemme i hvilken sammenheng eller hvilke gener som er regulert er en empirisk prosess. Et godt utgangspunkt for å evaluere denne funksjonen er å bruke det klassiske minigene verktøyet. Her presenterer vi den adenovirale E1A minigene-bruken for evaluering av de alternative skjøteendringene etter forskjellige cellulære stressstimuli. Vi evaluerte skjøtingen av E1A minigene i HEK293 stabilt overekspresserende Nek4-protein etter ulike stressende behandlinger. Protokollen inkluderer E1A minigene transfeksjon, cellebehandling, RNA-ekstraksjon og cDNA-syntese, etterfulgt av PCR- og gelanalyse og kvantifisering av de skjøtede variantene av E1A. Bruken av denne enkle og veletablerte metoden kombinert med spesifikke behandlinger er et pålitelig utgangspunkt for å belyse cellulære prosesser eller hvilke gener som kan reguleres av mRNA-skjøting.
Introduction
Skjøting er blant de viktigste trinnene i eukaryotisk mRNA-behandling som skjer samtidig til 5’mRNA capping og 3’mRNA polyadenylering, bestående av intronfjerning etterfulgt av exon junction. Anerkjennelsen av skjøteplassene (SS) av skjøteosomet, et ribonucleoproteinkompleks som inneholder små ribonukleoproteiner (snRNP U1, U2, U4 og U6), små RNAer (snRNAer) og flere regulatoriske proteiner1 er nødvendig for skjøting.
Foruten intronfjerning (konstituerende skjøting), i eukaryoter, kan introner beholdes og eksoner kan utelukkes, og konfigurerer prosessen som kalles mRNA alternativ skjøting (AS). Den alternative pre-mRNA skjøtingen utvider kodingskapasiteten til eukaryote genomer slik at produksjonen av et stort og mangfoldig antall proteiner fra et relativt lite antall gener. Det er anslått at 95-100% av menneskelige mRNAer som inneholder mer enn en exon kan gjennomgå alternativ skjøting2,3. Dette er grunnleggende for biologiske prosesser som nevronutvikling, apoptoseaktivering og cellulær stressrespons4, og gir organismealternativene for å regulere cellefunksjon ved hjelp av samme repertoar av gener.
Maskinene som er nødvendige for alternativ skjøting er det samme som brukes til konstituerende skjøting, og bruken av SS er hoveddeterminanten for alternativ skjøteforekomst. Konstituerende skjøting er relatert til bruk av sterke skjøteplasser, som vanligvis ligner mer på konsensusmotiver for skjøtemosomgjenkjenning5.
Alternative eksoner er vanligvis anerkjent mindre effektivt enn konstitutive eksoner når dens cis-regulatoriskeelementer, sekvensene i 5’SS og 3’SS flanking disse exons, viser en dårligere bindende kapasitet til skjøteosomet. mRNA inneholder også regioner som kalles forsterkere eller lyddempere plassert i eksoner (eksoniske skjøteforsterkere (ESE) og eksoniske skjøte lyddempere (ESSs)) og introner (introniske skjøteforsterkere (ISE) og introniske skjøte lyddempere (ISSs)) som forbedrer eller undertrykker eksonbruk, henholdsvis5. Disse sekvensene gjenkjennes av transregulatoriske elementer, eller skjøtefaktorer (SF). SFs er representert hovedsakelig av to familier av proteiner, serin / arginin rike skjøtefaktorer (SRSFer) som binder seg til ESE og familien av heterogene kjernefysiske ribonukleoproteiner (hnRNPer) som binder seg til ESSs-sekvenser5.
Alternativ skjøting kan moduleres ved fosforylering/ defosforylering av transfaktorer som endrer interaksjonspartnerne og cellulær lokalisering av skjøtefaktorer6,7,8. Identifisering av nye regulatorer av skjøtefaktorer kan gi nye verktøy for å regulere skjøting og følgelig noen kreftbehandlinger.
Anufrieva et al.9, i en mRNA mikroarray genuttrykksprofil, observerte konsistente endringer i nivåer av spleiseosomale komponenter i 101 cellelinjer og etter forskjellige stressforhold (platinabaserte legemidler, gammabestråling, topoisomerasehemmere, tyrosinkinasehemmere og taxanes). Forholdet mellom skjøtemønster og kjemoterapi effekt er allerede vist i lungekreftceller, som er kjemoterapi resistente, viser endringer i caspase-9 varianter rate10. HEK293 celler behandlet med kjemoterapeutisk panel viser endringer i skjøting med en økning i pro-apoptotiske varianter. Gabriel et al.11 observerte endringer i minst 700 tilfeller av skjøting etter cisplatinbehandling i forskjellige cellelinjer, og påpekte at skjøtebaner er cisplatin-påvirket. Skjøtemodulatorer har allerede vist anti-tumoral aktivitet, som viser at skjøting er viktig for tumorutvikling og hovedsakelig kjemoterapirespons12. Derfor er karakterisering av nye proteiner som regulerer skjøting etter cellulære stressorer, som kjemoterapeutiske midler, svært viktig for å oppdage nye behandlingsstrategier.
Ledetrådene om alternativ skjøteregulering fra interaktivitetsstudier, spesielt viktig for å karakterisere funksjoner av nye eller ukarakteriserte proteiner, kan kreve en mer generell og enkel tilnærming for å verifisere proteinets reelle rolle i AS. Minigenes er viktige verktøy for analyse av den generelle rollen til et protein som påvirker skjøtereguleringen. De inneholder segmenter fra et gen av interesse som inneholder alternativt spleisede og flankende genomiske regioner13. Ved hjelp av et minigene verktøy tillater analysen av skjøting in vivo med flere fordeler som lengden på minigene som er mindre og derfor ikke er en begrensning i forsterkningsreaksjonen; den samme minigene kan evalueres i forskjellige cellelinjer; alle cellulære komponenter, hovedsakelig deres regulerende post-translasjonsmodifikasjon (fosforylering og endringer i cellerom) er til stede og kan adresseres13,14. Videre kan endringer i alternativt skjøtemønster observeres etter cellulært stress og, bruken av et minigensystem, tillate å identifisere banen som moduleres av forskjellige stimuli.
Det er flere minigene systemer som allerede er beskrevet som er spesifikke for ulike typer skjøtehendelser13,14, men som en foreløpig analyse er minigeneE1A 15 et meget godt etablert alternativt skjøtereportersystem for studiet av 5’SS utvalg in vivo. Fra bare ett gen, E1A, produseres fem mRNAer ved alternativ skjøting basert på utvalg av tre forskjellige 5′ skjøteplasser og av en stor eller en mindre 3′ skjøte sted16,17,18. Uttrykket av E1A-varianter endres i henhold til perioden for Adenoviral infeksjon19,20.
Vi har tidligere vist at både Nek4 isoformer samhandler med skjøtefaktorer som SRSF1 og hnRNPA1, og mens isoform 2 endrer minigene E1A alternativ skjøting, isoform 1 har ingen effekt i at21. Fordi isoform 1 er den mest tallrike isoformen og endrer kjemoterapimotstand og DNA-skaderespons, vurderer vi om det kan endre minigene E1A alternativ skjøting i en stresstilstand.
Minigene analyser er en enkel, rimelig og rask metode, siden den bare trenger RNA-ekstraksjon, cDNA-syntese, forsterkning og agarosegelanalyser, og kan være et nyttig verktøy for å evaluere siden en mulig effekt på alternativ skjøting av et protein av interesser til effekten av forskjellige behandlinger på cellulært alternativt skjøtemønster.
Protocol
Representative Results
Discussion
Minigenes er viktige verktøy for å bestemme effektene i global alternativ skjøting in vivo. Den adenovirale minigene E1A har blitt brukt med hell i flere tiår for å evaluere proteinenes rolle ved å øke mengden av disse i celle13,14. Her foreslår vi minigene E1A-bruk for å evaluere alternativ skjøting etter kjemoterapeutisk eksponering. En stabil cellelinje som uttrykker Nek4 isoform 1 ble brukt, og unngår artefakter av overekspression forårsaket av fo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, gjennom Grant Temático 2017/03489-1 til JK og stipendiatstilling til FLB 2018/05350-3) og Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) for finansiering av denne forskningen. Vi vil gjerne takke Dr Adrian Krainer for å gi pMTE1A plasmid og Zerler og kolleger for deres arbeid i E1A kloning. Vi takker også professor Dr. Patrícia Moriel, prof. Dr. Wanda Pereira Almeida, prof. Dr. Marcelo Lancellotti og prof. Dr. Karina Kogo Cogo Müller for å tillate oss å bruke laboratorieplassen og utstyret deres.
Materials
| 100 pb DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | |
| 6 wells plate | Sarstedt | 833920 | |
| Agarose | Sigma | A9539-250G | |
| Cisplatin | Sigma | P4394 | |
| DEPC water | ThermoFisher | AM9920 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965118 | |
| dNTP mix | ThermoFisher | 10297-018 | |
| Fetal Bovine Serum – FBS | ThermoFisher | 12657029 | |
| Fluorescent Microscope | Leica | DMIL LED FLUO | |
| Gel imaging acquisition system – ChemiDoc Gel Imagin System | Bio-Rad | ||
| GFP – pEGFPC3 | Clontech | ||
| HEK293 stable cells – HEK293 Flp-In | Generated from Flp-In™ T-REx™ 293 – Invitrogen and described in ref 21 | ||
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | Used for Flp-In cells maintenemant |
| Image processing and analysis software – FIJI software | ref. 32 | ||
| Lipid- based transfection reagent – jetOPTIMUS Polyplus Reagent | Polyplus | 117-07 | |
| Oligo DT | ThermoFisher | 18418020 | |
| Paclitxel | Invitrogen | P3456 | |
| Plate Reader/ UV absorbance | Biotech | Epoch Biotek/ Take3 adapter | |
| pMTE1A plasmid | Provided by Dr. Adrian Krainer | ||
| pMTE1A F | Invitrogen | 5’ -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3 | |
| pMTE1A R | Invitrogen | 5’ -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3’ | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | F5810R | |
| Reverse Transcriptase – M-MLV | ThermoFisher | 28025013 | |
| Reverse transcriptase – Superscript IV | ThermoFisher | 18090050 | |
| Ribunuclease inhibitor RNAse OUT | ThermoFisher | 10777-019 | |
| RNA extraction phenol-chloroform based reagent – Trizol | ThermoFisher | 15596018 | |
| SybrSafe DNA gel stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Taq Platinum | Thermo | 10966026 | |
| Tetracyclin | Sigma | T3383 | Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction |
| Thermocycler Bio-Rad | Bio-Rad | T100 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
Referências
- Ule, J., Blencowe, B. J. Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution. Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics. 40 (12), 1413-1415 (2008).
- Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature. 463 (7280), 457-463 (2010).
- Stamm, S. Signals and their transduction pathways regulating alternative splicing: a new dimension of the human genome. Human Molecular Genetics. 11 (20), 2409-2416 (2002).
- Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
- Zhong, X. -. Y., Ding, J. -. H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -. D. Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones. Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).
- Misteli, T., Cáceres, J. F., Clement, J. Q., Krainer, A. R., Wilkinson, M. F., Spector, D. L. Serine Phosphorylation of SR Proteins Is Required for Their Recruitment to Sites of Transcription In Vivo. Journal of Cell Biology. 143 (2), 297-307 (1998).
- Kanopka, A., et al. Regulation of adenovirus alternative RNA splicing by dephosphorylation of SR proteins. Nature. 393 (6681), 185-187 (1998).
- Anufrieva, K. S., et al. Therapy-induced stress response is associated with downregulation of pre-mRNA splicing in cancer cells. Genome Medicine. 10 (1), 49 (2018).
- Shultz, J. C., et al. SRSF1 Regulates the Alternative Splicing of Caspase 9 Via A Novel Intronic Splicing Enhancer Affecting the Chemotherapeutic Sensitivity of Non-Small Cell Lung Cancer Cells. Molecular Cancer Research. 9 (7), 889-900 (2011).
- Gabriel, M., et al. Role of the splicing factor SRSF4 in cisplatin-induced modifications of pre-mRNA splicing and apoptosis. BMC Cancer. 15, (2015).
- Lee, S. C. -. W., Abdel-Wahab, O. Therapeutic targeting of splicing in cancer. Nature Medicine. 22 (9), 976-986 (2016).
- Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37 (4), 331-340 (2005).
- Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing. Brain Research Protocols. 4 (3), 383-394 (1999).
- Zerler, B., et al. Adenovirus E1A coding sequences that enable ras and pmt oncogenes to transform cultured primary cells. Molecular and Cellular Biology. 6 (3), 887-899 (1986).
- Gattoni, R., Schmitt, P., Stevenin, J. In vitro splicing of adenovirus E1A transcripts: characterization of novel reactions and of multiple branch points abnormally far from the 3′ splice site. Nucleic Acids Research. 16 (6), 2389-2409 (1988).
- Stephens, C., Harlow, E. Differential splicing yields novel adenovirus 5 E1A mRNAs that encode 30 kd and 35 kd proteins. The EMBO journal. 6 (7), 2027-2035 (1987).
- Ulfendahl, P. J., et al. A novel adenovirus-2 E1A mRNA encoding a protein with transcription activation properties. The EMBO journal. 6 (7), 2037-2044 (1987).
- Berk, A. J., Sharp, P. A. Structure of the adenovirus 2 early mRNAs. Cell. 14 (3), 695-711 (1978).
- Svensson, C., Pettersson, U., Akusjärvi, G. Splicing of adenovirus 2 early region 1A mRNAs is non-sequential. Journal of Molecular Biology. 165 (3), 475-495 (1983).
- Basei, F. L., Meirelles, G. V., Righetto, G. L., dos Santos Migueleti, D. L., Smetana, J. H. C., Kobarg, J. New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing. Proteome Science. 13 (1), 11 (2015).
- Zhou, Z., et al. The Akt-SRPK-SR Axis Constitutes a Major Pathway in Transducing EGF Signaling to Regulate Alternative Splicing in the Nucleus. Molecular Cell. 47 (3), 422-433 (2012).
- Caceres, J., Stamm, S., Helfman, D., Krainer, A. Regulation of alternative splicing in vivo by overexpression of antagonistic splicing factors. Science. 265 (5179), 1706-1709 (1994).
- Zhong, X. -. Y., Ding, J. -. H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -. D. Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones. Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).
- Naro, C., et al. The centrosomal kinase NEK2 is a novel splicing factor kinase involved in cell survival. Nucleic Acids Research. 42 (5), 3218-3227 (2014).
- Lu, C. -. C., Chen, T. -. H., Wu, J. -. R., Chen, H. -. H., Yu, H. -. Y., Tarn, W. -. Y. Phylogenetic and Molecular Characterization of the Splicing Factor RBM4. PLoS ONE. 8 (3), 59092 (2013).
- Jarnæss, E., et al. Splicing Factor Arginine/Serine-rich 17A (SFRS17A) Is an A-kinase Anchoring Protein That Targets Protein Kinase A to Splicing Factor Compartments. Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 35154-35164 (2009).
- Bressan, G. C., et al. Functional association of human Ki-1/57 with pre-mRNA splicing events. FEBS Journal. 276 (14), 3770-3783 (2009).
- Vivarelli, S., et al. Paraquat Modulates Alternative Pre-mRNA Splicing by Modifying the Intracellular Distribution of SRPK2. PLoS ONE. 8 (4), 61980 (2013).
- Russell, W. C., Graham, F. L., Smiley, J., Nairn, R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5. Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: A simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bai, Y. Control of 3′ splice site choice in vivo by ASF/SF2 and hnRNP A1. Nucleic Acids Research. 27 (4), 1126-1134 (1999).
- Cote, G. J., Nguyen, N., Lips, C. J. M., Berget, S. M., Gagel, R. F. Validation of an in vitro RNA processing system for CT/CGRP precursor mRNA. Nucleic Acids Research. 19 (13), 3601-3606 (1991).
