Использование инструмента E1A Minigene для изучения изменений сплайсинга мРНК
Summary
Этот протокол представляет собой быстрый и полезный инструмент для оценки роли белка с неохарактерной функцией в альтернативной регуляции сплайсинга после химиотерапевтического лечения.
Abstract
Обработка мРНК включает в себя несколько одновременных этапов подготовки мРНК к трансляции, таких как 5’capping, поли-A сложение и сплайсинг. Помимо конститутивного сплайсинга, альтернативное сплайсинг мРНК позволяет экспрессифицирование многофункциональных белков из одного гена. Поскольку исследования интерактома, как правило, являются первым анализом новых или неизвестных белков, ассоциация белка приманки с факторами сплайсинга является признаком того, что он может участвовать в процессе сплайсинга мРНК, но определение того, в каком контексте или какие гены регулируются, является эмпирическим процессом. Хорошей отправной точкой для оценки этой функции является использование классического инструмента минигена. Здесь мы представляем использование минигена аденовирусного E1A для оценки альтернативных изменений сплайсинга после различных клеточных стрессовых стимулов. Мы оценили сращивание минигена E1A в HEK293, стабильно сверхэкспрессирующего белок Nek4 после различных стрессовых процедур. Протокол включает в себя трансфекцию минигена E1A, обработку клеток, экстракцию РНК и синтез кДНК, за которыми следует ПЦР и гель-анализ и количественная оценка сращиваемых вариантов E1A. Использование этого простого и хорошо заявидского метода в сочетании со специфическими методами лечения является надежной отправной точкой для того, чтобы пролить свет на клеточные процессы или на то, какие гены могут регулироваться сращиванием мРНК.
Introduction
Сплайсинг является одним из наиболее важных этапов в обработке эукариотической мРНК, которая происходит одновременно с укупорки 5’мРНК и полиаденилированием 3’мРНК, включая удаление интрона с последующим переходом экзона. Для сплайсинга необходимо распознавание сайтов сплайсинга (SS) сплайсеосомой, рибонуклеопротеинового комплекса, содержащего мелкие рибонуклеопротеины (snRNP U1, U2, U4 и U6), малые РНК (snRNAs) и несколько регуляторных белков1.
Помимо удаления интронов (конститутивного сплайсинга), у эукариот интроны могут быть сохранены, а экзоны могут быть исключены, конфигурируя процесс, называемый альтернативным сплайсингом мРНК (AS). Альтернативное сплайсинг премрнК расширяет кодирующую способность эукариотических геномов, позволяя продуцировать большое и разнообразное количество белков из относительно небольшого числа генов. Подсчитано, что 95-100% человеческих мРНК, содержащих более одного экзона, могут подвергаться альтернативному сращиваниям2,3. Это имеет основополагающее значение для биологических процессов, таких как развитие нейронов, активация апоптоза и клеточная реакция на стресс4,предоставляя организму альтернативы для регулирования функционирования клеток с использованием одного и того же репертуара генов.
Механизм, необходимый для альтернативного сращивания, используется для конститутивного сращивания, а использование SS является основным определяющим фактором для альтернативного сращивания. Конститутивное сплайсинг связано с использованием сильных сайтов сплайсинга, которые обычно больше похожи на консенсусные мотивы для распознавания сплайсеосом5.
Альтернативные экзоны обычно распознаются менее эффективно, чем конститутивные экзоны, когда его цис-регуляторныеэлементы, последовательности в 5’SS и 3’SS, фланкирующие эти экзоны, показывают более низкую связывающую способность со сплайсеосомой. мРНК также содержит области, называемые энхансерами или глушителями, расположенными в экзонах (экзонные усилители сплайсинга (EES) и экзонные глушители сплайсинга (ESS)) и интронах (интронные усилители сплайсинга (ISEs) и интронные глушители сплайсинга (ISS)), которые усиливают или подавляют использование экзона, соответственно5. Эти последовательности распознаются трансрегулятивными элементами, или факторами сплайсинга (SF). SF представлены в основном двумя семействами белков: богатыми серином/аргинином факторами сплайсинга (SRSF), которые связываются с EES, и семейством гетерогенных ядерных рибонуклеопротеинов (hnRNP), которые связываются с последовательностями ЭСС5.
Альтернативное сплайсинг может модулироваться фосфорилированием/дефосфорилированием трансфакторов, модифицирующих взаимодействия партнеров и клеточной локализацией факторов сплайсинга6,7,8. Выявление новых регуляторов факторов сплайсинга может предоставить новые инструменты для регулирования сплайсинга и, следовательно, некоторых методов лечения рака.
Anufrieva et al.9,в профиле экспрессии гена микрочипа мРНК, наблюдали последовательные изменения уровней сплайсеосомальных компонентов в 101 клеточной линии и после различных стрессовых состояний (препараты на основе платины, гамма-облучение, ингибиторы топоизомеразы, ингибиторы тирозинкиназы и таксаны). Связь между паттерном сплайсинга и эффективностью химиотерапии уже была продемонстрирована в клетках рака легких, которые устойчивы к химиотерапии, показывая изменения в вариантах каспазы-910. Клетки HEK293, обработанные химиотерапевтической панелью, показывают изменения в сплайсинго с увеличением проапоптотических вариантов. Gabriel et al.11 наблюдали изменения по меньшей мере в 700 случаях сплайсинга после лечения цисплатином в различных клеточных линиях, указывая, что сплайсинговые пути подвержены влиянию цисплатина. Модуляторы сплайсинга уже продемонстрировали противоопухоляющую активность, показав, что сплайсинг важен для развития опухоли и, главным образом, ответа химиотерапии12. Следовательно, характеристика новых белков, которые регулируют сплайсинг после клеточных стрессоров, таких как химиотерапия, очень важна для открытия новых стратегий лечения.
Подсказки альтернативной регуляции сплайсинга из интерактомных исследований, особенно важные для характеристики функций новых или нехарактеризованных белков, могут потребовать более общего и простого подхода для проверки реальной роли белка в АС. Минигены являются важными инструментами для анализа общей роли белка, влияющего на регуляцию сплайсинга. Они содержат сегменты из интересующего гена, содержащие альтернативно сращенные и фланкированные геномныеобласти 13. Использование минигенного инструмента позволяет анализировать сращивание in vivo с рядом преимуществ, таких как длина минигена, которая незначительна и, следовательно, не является ограничением реакции усиления; один и тот же миниген может быть оценен в разных клеточных линиях; все клеточные компоненты, главным образом их регулирующая постпрокродная модификация (фосфорилирование и изменения в клеточных компартментах) присутствуют и могут быть рассмотрены13,14. Более того, изменения в альтернативной схеме сплайсинга могут наблюдаться после клеточного стресса и, используя минигенную систему, позволяют идентифицировать путь, модулируемый различными раздражителями.
Существует несколько уже описанных минигенных систем, которые специфичны для различных видов событий сплайсинга13,14,однако, в качестве предварительного анализа, миниген E1A15 является очень хорошо зарекомендовавшей себя альтернативной сплайсинговой репортерной системой для изучения отбора 5’SS in vivo. Только из одного гена, E1A, пять мРНК продуцируются альтернативным сплайсингом на основе отбора трех различных 5′ сайтов сращивания и одного крупного или одного минорного 3′-сращиваниясайта 16,17,18. Экспрессия вариантов Е1А изменяется в зависимости от периода аденовирусной инфекции19,20.
Ранее мы показали, что обе изоформы Nek4 взаимодействуют с факторами сплайсинга, такими как SRSF1 и hnRNPA1, и хотя изоформа 2 изменяет миниген альтернативного сплайсинга E1A, изоформа 1 не влияет на этот21. Поскольку изоформа 1 является наиболее распространенной изоформой и изменяет устойчивость к химиотерапии и реакцию на повреждение ДНК, мы оцениваем, может ли она изменить альтернативное сращивание минигена E1A в стрессовом состоянии.
Анализ минигена является простым, недорогим и быстрым методом, поскольку он требует только экстракции РНК, синтеза кДНК, амплификации и анализа агарозного геля и может быть полезным инструментом для оценки, поскольку возможно влияние на альтернативное сплайсинг белка, представляющим интерес, до влияния различных методов лечения на клеточную альтернативную схему сплайсинга.
Protocol
Representative Results
Discussion
Минигены являются важными инструментами для определения эффектов в глобальном альтернативном сплайсинге in vivo. Аденовирусный миниген E1A успешно используется в течение десятилетий для оценки роли белков путем увеличения их количества в клетке13,14. Здесь ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, через грант Temático 2017/03489-1 для JK и стипендию FLB 2018/05350-3) и Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) за финансирование этого исследования. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Адриана Крайнера за предоставление плазмиды pMTE1A и Церлера и его коллег за их работу по клонированию E1A. Мы также благодарим профессора д-ра Патрисию Мориэль, профессора д-ра Ванду Перейру Алмейду, профессора д-ра Марсело Ланчелотти и профессора д-ра Карину Кого Кого Мюллер за то, что они позволили нам использовать их лабораторные помещения и оборудование.
Materials
| 100 pb DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | |
| 6 wells plate | Sarstedt | 833920 | |
| Agarose | Sigma | A9539-250G | |
| Cisplatin | Sigma | P4394 | |
| DEPC water | ThermoFisher | AM9920 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965118 | |
| dNTP mix | ThermoFisher | 10297-018 | |
| Fetal Bovine Serum – FBS | ThermoFisher | 12657029 | |
| Fluorescent Microscope | Leica | DMIL LED FLUO | |
| Gel imaging acquisition system – ChemiDoc Gel Imagin System | Bio-Rad | ||
| GFP – pEGFPC3 | Clontech | ||
| HEK293 stable cells – HEK293 Flp-In | Generated from Flp-In™ T-REx™ 293 – Invitrogen and described in ref 21 | ||
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | Used for Flp-In cells maintenemant |
| Image processing and analysis software – FIJI software | ref. 32 | ||
| Lipid- based transfection reagent – jetOPTIMUS Polyplus Reagent | Polyplus | 117-07 | |
| Oligo DT | ThermoFisher | 18418020 | |
| Paclitxel | Invitrogen | P3456 | |
| Plate Reader/ UV absorbance | Biotech | Epoch Biotek/ Take3 adapter | |
| pMTE1A plasmid | Provided by Dr. Adrian Krainer | ||
| pMTE1A F | Invitrogen | 5’ -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3 | |
| pMTE1A R | Invitrogen | 5’ -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3’ | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | F5810R | |
| Reverse Transcriptase – M-MLV | ThermoFisher | 28025013 | |
| Reverse transcriptase – Superscript IV | ThermoFisher | 18090050 | |
| Ribunuclease inhibitor RNAse OUT | ThermoFisher | 10777-019 | |
| RNA extraction phenol-chloroform based reagent – Trizol | ThermoFisher | 15596018 | |
| SybrSafe DNA gel stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Taq Platinum | Thermo | 10966026 | |
| Tetracyclin | Sigma | T3383 | Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction |
| Thermocycler Bio-Rad | Bio-Rad | T100 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
Referências
- Ule, J., Blencowe, B. J. Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution. Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics. 40 (12), 1413-1415 (2008).
- Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature. 463 (7280), 457-463 (2010).
- Stamm, S. Signals and their transduction pathways regulating alternative splicing: a new dimension of the human genome. Human Molecular Genetics. 11 (20), 2409-2416 (2002).
- Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
- Zhong, X. -. Y., Ding, J. -. H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -. D. Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones. Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).
- Misteli, T., Cáceres, J. F., Clement, J. Q., Krainer, A. R., Wilkinson, M. F., Spector, D. L. Serine Phosphorylation of SR Proteins Is Required for Their Recruitment to Sites of Transcription In Vivo. Journal of Cell Biology. 143 (2), 297-307 (1998).
- Kanopka, A., et al. Regulation of adenovirus alternative RNA splicing by dephosphorylation of SR proteins. Nature. 393 (6681), 185-187 (1998).
- Anufrieva, K. S., et al. Therapy-induced stress response is associated with downregulation of pre-mRNA splicing in cancer cells. Genome Medicine. 10 (1), 49 (2018).
- Shultz, J. C., et al. SRSF1 Regulates the Alternative Splicing of Caspase 9 Via A Novel Intronic Splicing Enhancer Affecting the Chemotherapeutic Sensitivity of Non-Small Cell Lung Cancer Cells. Molecular Cancer Research. 9 (7), 889-900 (2011).
- Gabriel, M., et al. Role of the splicing factor SRSF4 in cisplatin-induced modifications of pre-mRNA splicing and apoptosis. BMC Cancer. 15, (2015).
- Lee, S. C. -. W., Abdel-Wahab, O. Therapeutic targeting of splicing in cancer. Nature Medicine. 22 (9), 976-986 (2016).
- Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37 (4), 331-340 (2005).
- Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing. Brain Research Protocols. 4 (3), 383-394 (1999).
- Zerler, B., et al. Adenovirus E1A coding sequences that enable ras and pmt oncogenes to transform cultured primary cells. Molecular and Cellular Biology. 6 (3), 887-899 (1986).
- Gattoni, R., Schmitt, P., Stevenin, J. In vitro splicing of adenovirus E1A transcripts: characterization of novel reactions and of multiple branch points abnormally far from the 3′ splice site. Nucleic Acids Research. 16 (6), 2389-2409 (1988).
- Stephens, C., Harlow, E. Differential splicing yields novel adenovirus 5 E1A mRNAs that encode 30 kd and 35 kd proteins. The EMBO journal. 6 (7), 2027-2035 (1987).
- Ulfendahl, P. J., et al. A novel adenovirus-2 E1A mRNA encoding a protein with transcription activation properties. The EMBO journal. 6 (7), 2037-2044 (1987).
- Berk, A. J., Sharp, P. A. Structure of the adenovirus 2 early mRNAs. Cell. 14 (3), 695-711 (1978).
- Svensson, C., Pettersson, U., Akusjärvi, G. Splicing of adenovirus 2 early region 1A mRNAs is non-sequential. Journal of Molecular Biology. 165 (3), 475-495 (1983).
- Basei, F. L., Meirelles, G. V., Righetto, G. L., dos Santos Migueleti, D. L., Smetana, J. H. C., Kobarg, J. New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing. Proteome Science. 13 (1), 11 (2015).
- Zhou, Z., et al. The Akt-SRPK-SR Axis Constitutes a Major Pathway in Transducing EGF Signaling to Regulate Alternative Splicing in the Nucleus. Molecular Cell. 47 (3), 422-433 (2012).
- Caceres, J., Stamm, S., Helfman, D., Krainer, A. Regulation of alternative splicing in vivo by overexpression of antagonistic splicing factors. Science. 265 (5179), 1706-1709 (1994).
- Zhong, X. -. Y., Ding, J. -. H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -. D. Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones. Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).
- Naro, C., et al. The centrosomal kinase NEK2 is a novel splicing factor kinase involved in cell survival. Nucleic Acids Research. 42 (5), 3218-3227 (2014).
- Lu, C. -. C., Chen, T. -. H., Wu, J. -. R., Chen, H. -. H., Yu, H. -. Y., Tarn, W. -. Y. Phylogenetic and Molecular Characterization of the Splicing Factor RBM4. PLoS ONE. 8 (3), 59092 (2013).
- Jarnæss, E., et al. Splicing Factor Arginine/Serine-rich 17A (SFRS17A) Is an A-kinase Anchoring Protein That Targets Protein Kinase A to Splicing Factor Compartments. Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 35154-35164 (2009).
- Bressan, G. C., et al. Functional association of human Ki-1/57 with pre-mRNA splicing events. FEBS Journal. 276 (14), 3770-3783 (2009).
- Vivarelli, S., et al. Paraquat Modulates Alternative Pre-mRNA Splicing by Modifying the Intracellular Distribution of SRPK2. PLoS ONE. 8 (4), 61980 (2013).
- Russell, W. C., Graham, F. L., Smiley, J., Nairn, R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5. Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: A simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bai, Y. Control of 3′ splice site choice in vivo by ASF/SF2 and hnRNP A1. Nucleic Acids Research. 27 (4), 1126-1134 (1999).
- Cote, G. J., Nguyen, N., Lips, C. J. M., Berget, S. M., Gagel, R. F. Validation of an in vitro RNA processing system for CT/CGRP precursor mRNA. Nucleic Acids Research. 19 (13), 3601-3606 (1991).
