mRNA Birleştirme Değişikliklerini incelemek için E1A Minigene Aracını Kullanma
Summary
Bu protokol, kemoterapötik tedaviden sonra alternatif birleştirme regülasyonunda karakteristik olmayan işleve sahip bir proteinin rolünü değerlendirmek için hızlı ve kullanışlı bir araç sunar.
Abstract
mRNA işleme, mRNA’yı çeviriye hazırlamak için 5’kapaklama, çoklu A ekleme ve birleştirme gibi birden fazla eşzamanlı adım içerir. Konsültasyonel birleştirmenin yanı sıra, alternatif mRNA birleştirme, bir genden çok fonksiyonlu proteinlerin ifadesini sağlar. Interactome çalışmaları genellikle yeni veya bilinmeyen proteinler için ilk analiz olduğundan, yem proteininin birleştirme faktörleriyle ilişkilendirmesi, mRNA birleştirme sürecine katılabileceğinin bir göstergesidir, ancak hangi bağlamda veya hangi genlerin düzenlendiğini belirlemek ampirik bir süreçtir. Bu işlevi değerlendirmek için iyi bir başlangıç noktası klasik minigene aracını kullanmaktır. Burada, farklı hücresel stres uyaranları sonrası alternatif birleştirme değişikliklerini değerlendirmek için adenoviral E1A minigene kullanımını sunuyoruz. Farklı stres tedavilerinden sonra NEK4 proteinini bıçaklayarak HEK293’te E1A minigene’nin birlenmesini değerlendirdik. Protokol, E1A minigene transfection, hücre tedavisi, RNA ekstraksiyonu ve cDNA sentezini, ardından PCR ve jel analizini ve E1A ekli varyantların nicelleştirilmesini içerir. Bu basit ve köklü yöntemin belirli tedavilerle birlikte kullanılması, hücresel süreçlere veya mRNA birleştirme ile hangi genlerin düzenlenebileceğine ışık tutmak için güvenilir bir başlangıç noktasıdır.
Introduction
Birleştirme, 5’mRNA kapaklama ve 3’mRNA poliadenilasyonuna aynı anda meydana gelen ökaryotik mRNA işlemede en önemli adımlar arasındadır, intron kaldırma ve ardından exon kavşağı. Birleştirme alanlarının (SS) spliceosome tarafından tanınması, küçük ribonükleoproteinler (snRNP U1, U2, U4 ve U6), küçük RNA’lar (snRNA’lar) ve birkaç düzenleyici protein1 içeren bir ribonükleoprotein kompleksi, birleştirme için gereklidir.
Ökaryotlarda intron kaldırmanın (konsitutive birleştirme) yanı sıra, intronlar tutulabilir ve eksonlar dışlanabilir, mRNA alternatif birleştirme (AS) adı verilen işlemi yapılandırabilir. Alternatif pre-mRNA birleştirme, ökaryotik genomların kodlama kapasitesini genişleterek nispeten az sayıda genden çok sayıda protein üretilmesini sağlar. Birden fazla ekson içeren insan mRNA’larının% 95-100’ünün alternatif birleştirme2,3’tengeçebileceği tahmin edilmektedir. Bu, nöronal gelişim, apoptoz aktivasyonu ve hücresel stres yanıtı4gibi biyolojik süreçler için temeldir Organizmaya aynı gen repertuarını kullanarak hücre işleyişini düzenlemek için alternatifler sağlar.
Alternatif birleştirme için gerekli makine, konsitütif birleştirme için kullanılanla aynıdır ve SS kullanımı alternatif birleştirme oluşumu için ana belirleyicidir. Constitutive birleştirme, genellikle spliceosome tanıma için konsensüs motiflerine daha benzer olan güçlü birleştirme alanlarının kullanımı ile ilgilidir5.
Alternatif eksonlar tipik olarak, cis düzenleyiciunsurları, 5’SS ve 3’SS’deki diziler bu eksonları kuşatırken, spliceosome için daha düşük bir bağlama kapasitesi gösterdiğinde, konstrüktif eksonlardan daha az verimli olarak tanınır. mRNA ayrıca eksonlarda (eksonik birleştirme arttırıcıları (ESE’ler) ve eksonik birleştirme susturucularında (ESSs)) ve intronlarda (intronic splicing enhancers (ISS) ve intronic splicing susturucularında (ISSs)) bulunan ve eksonik kullanımı artıran veya bastıran güçlendiriciler veya susturucular (ISSs) adlı bölgeleriiçerir. Bu diziler, düzenleyici öğeler veya birleştirme faktörleri (SF) tarafından tanınır. SF’ler esas olarak iki protein ailesi tarafından temsil edilir, ESE’lere bağlanan serine / arginin zengin birleştirme faktörleri (SRSF’ler) ve ESSs dizilerine bağlanan heterojen nükleer ribonükleoproteinler (hnRNPs) ailesi5.
Alternatif birleştirme, etkileşim ortaklarını değiştiren trans faktörlerin fosforilasyonu / defosforilasyonu ve birleştirme faktörlerinin hücresel lokalizasyonu ile modüle edilebilir6,7,8. Birleştirme faktörlerinin yeni düzenleyicilerinin belirlenmesi, birleştirmeyi ve dolayısıyla bazı kanser tedavilerini düzenlemek için yeni araçlar sağlayabilir.
Anufrieva ve ark.9, bir mRNA mikroarray gen ekspresyon profilinde, 101 hücre hattında ve farklı stres koşullarından sonra (platin bazlı ilaçlar, gama ışınlama, topoisomeraz inhibitörleri, tirozin kinaz inhibitörleri ve taksonlar) spliceosomal bileşenlerin seviyelerinde tutarlı değişiklikler gözlemledi. Birleştirme paterni ve kemoterapi etkinliği arasındaki ilişki, kemoterapiye dirençli olan akciğer kanseri hücrelerinde, kaspaz-9 varyantları oranındaki değişiklikleri gösteren10. Kemoterapötik panel ile tedavi edilen HEK293 hücreleri, pro-apoptotik varyantlarda bir artışla birleştirmede değişiklikler göstermektedir. Gabriel ve ark.11, farklı hücre hatlarında cisplatin tedavisinden sonra en az 700 birleştirme etkinliğinde değişiklikler gözlemledi ve birleştirme yollarının cisplatin etkilendiğine işaret etti. Birleştirme modülatörleri, birleştirmenin tümöral gelişim ve esas olarak kemoterapi yanıtı 12 için önemli olduğunu gösteren anti-tümöral aktivitegöstermiştir. Bu nedenle, kemoterapötikler gibi hücresel stresör ajanlarından sonra birleştirmeyi düzenleyen yeni proteinleri karakterize etmek, yeni tedavi stratejilerini keşfetmek için çok önemlidir.
Interactome çalışmalarından alternatif birleştirme düzenlemesinin ipuçları, özellikle yeni veya karakteristik olmayan proteinlerin işlevlerini karakterize etmek için önemlidir, proteinin AS’deki gerçek rolünü doğrulamak için daha genel ve basit bir yaklaşım talep edebilir. Minigenler, birleştirme regülasyonını etkileyen bir proteinin genel rolünün analizi için önemli araçlardır. Alternatif olarak birikmiş ve kuşatıcı genomik bölgeler içeren ilgi geninden segmentler içerirler13. Bir minigene aracı kullanmak, minigenenin uzunluğu gibi küçük olan ve bu nedenle amplifikasyon reaksiyonu için bir sınırlama olmayan çeşitli avantajlarla in vivo birleştirmenin analizini sağlar; aynı minigene farklı hücre hatlarında değerlendirilebilir; tüm hücresel bileşenler, esas olarak çeviri sonrası modifikasyonlarını düzenleyen (fosforilasyon ve hücre bölmelerindeki değişiklikler) mevcuttur ve13,14. Ayrıca, hücresel stres sonrası alternatif birleştirme düzenindeki değişiklikler gözlenebilir ve minigene sisteminin kullanımı, farklı uyaranlar tarafından modüle edilen yolu tanımlamaya izin verir.
13,14, ancak, ön test olarak, minigeneE1A 15,5’SS seçiminin vivo olarak incelenmesi için çok iyi kurulmuş bir alternatif birleştirme muhabir sistemidir. Sadece bir genden, E1A, beş mRNA’lar, üç farklı 5′ splice bölgesinin ve bir büyük veya bir küçük 3′ splice sitesinin seçimine dayalı alternatif birleştirme ile üretilir16,17,18. E1A varyantlarının ekspresyonu Adenoviral enfeksiyon dönemine göre değişir19,20.
Daha önce her iki Nek4 izoformlarının da SRSF1 ve hnRNPA1 gibi birleştirme faktörleriyle etkileşime girdiğini ve isoform 2 değişiklikleri E1A alternatif birleştirmeyi minigene ederken, isoform 1’in bu21. İzoform 1 en bol izoform olduğundan ve kemoterapi direncini ve DNA hasar yanıtını değiştirdiğinden, stres durumunda minigene E1A alternatif birleştirmeyi değiştirip değiştiremeyeceğini değerlendiriyoruz.
Minigene tahlil basit, düşük maliyetli ve hızlı bir yöntemdir, çünkü sadece RNA ekstraksiyonu, cDNA sentezi, amplifikasyon ve agarose jel analizlerine ihtiyaç duyar ve farklı tedavilerin hücresel alternatif birleştirme deseni üzerindeki etkisine kadar ilgi çekici bir protein tarafından alternatif birleştirme üzerinde olası bir etkiden bu yana değerlendirmek için yararlı bir araç olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Minigenes, küresel alternatif birleştirme in vivo etkilerini belirlemek için önemli araçlardır. Adenoviral minigene E1A,13,14hücredeki bunların miktarını artırarak proteinlerin rolünü değerlendirmek için on yıllardır başarıyla kullanılmaktadır. Burada, kemoterapötik maruziyet sonrası alternatif birleştirmeyi değerlendirmek için minigene E1A kullanımını öneriyoruz. Nek4 isoform 1’i ifade eden kararlı bir hücre hattı kullanıldı ve…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo’ya (FAPESP, Grant Temático 2017/03489-1’den JK’ya ve FLB 2018/05350-3)’e burs ve bu araştırmayı finanse etmek için Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) aracılığıyla. PMTE1A plazmid ve Zerler ve meslektaşlarına E1A klonlama çalışmalarından dolayı teşekkür ederiz. Ayrıca Prof. Dr. Patrícia Moriel, Prof. Dr. Wanda Pereira Almeida, Prof. Dr. Marcelo Lancellotti ve Prof. Dr. Karina Kogo Cogo Müller’e laboratuvar alan ve ekipmanlarını kullanmamızı sağlayan teşekkür ediyoruz.
Materials
| 100 pb DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | |
| 6 wells plate | Sarstedt | 833920 | |
| Agarose | Sigma | A9539-250G | |
| Cisplatin | Sigma | P4394 | |
| DEPC water | ThermoFisher | AM9920 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965118 | |
| dNTP mix | ThermoFisher | 10297-018 | |
| Fetal Bovine Serum – FBS | ThermoFisher | 12657029 | |
| Fluorescent Microscope | Leica | DMIL LED FLUO | |
| Gel imaging acquisition system – ChemiDoc Gel Imagin System | Bio-Rad | ||
| GFP – pEGFPC3 | Clontech | ||
| HEK293 stable cells – HEK293 Flp-In | Generated from Flp-In™ T-REx™ 293 – Invitrogen and described in ref 21 | ||
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | Used for Flp-In cells maintenemant |
| Image processing and analysis software – FIJI software | ref. 32 | ||
| Lipid- based transfection reagent – jetOPTIMUS Polyplus Reagent | Polyplus | 117-07 | |
| Oligo DT | ThermoFisher | 18418020 | |
| Paclitxel | Invitrogen | P3456 | |
| Plate Reader/ UV absorbance | Biotech | Epoch Biotek/ Take3 adapter | |
| pMTE1A plasmid | Provided by Dr. Adrian Krainer | ||
| pMTE1A F | Invitrogen | 5’ -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3 | |
| pMTE1A R | Invitrogen | 5’ -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3’ | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | F5810R | |
| Reverse Transcriptase – M-MLV | ThermoFisher | 28025013 | |
| Reverse transcriptase – Superscript IV | ThermoFisher | 18090050 | |
| Ribunuclease inhibitor RNAse OUT | ThermoFisher | 10777-019 | |
| RNA extraction phenol-chloroform based reagent – Trizol | ThermoFisher | 15596018 | |
| SybrSafe DNA gel stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Taq Platinum | Thermo | 10966026 | |
| Tetracyclin | Sigma | T3383 | Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction |
| Thermocycler Bio-Rad | Bio-Rad | T100 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
Referências
- Ule, J., Blencowe, B. J. Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution. Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics. 40 (12), 1413-1415 (2008).
- Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature. 463 (7280), 457-463 (2010).
- Stamm, S. Signals and their transduction pathways regulating alternative splicing: a new dimension of the human genome. Human Molecular Genetics. 11 (20), 2409-2416 (2002).
- Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
- Zhong, X. -. Y., Ding, J. -. H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -. D. Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones. Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).
- Misteli, T., Cáceres, J. F., Clement, J. Q., Krainer, A. R., Wilkinson, M. F., Spector, D. L. Serine Phosphorylation of SR Proteins Is Required for Their Recruitment to Sites of Transcription In Vivo. Journal of Cell Biology. 143 (2), 297-307 (1998).
- Kanopka, A., et al. Regulation of adenovirus alternative RNA splicing by dephosphorylation of SR proteins. Nature. 393 (6681), 185-187 (1998).
- Anufrieva, K. S., et al. Therapy-induced stress response is associated with downregulation of pre-mRNA splicing in cancer cells. Genome Medicine. 10 (1), 49 (2018).
- Shultz, J. C., et al. SRSF1 Regulates the Alternative Splicing of Caspase 9 Via A Novel Intronic Splicing Enhancer Affecting the Chemotherapeutic Sensitivity of Non-Small Cell Lung Cancer Cells. Molecular Cancer Research. 9 (7), 889-900 (2011).
- Gabriel, M., et al. Role of the splicing factor SRSF4 in cisplatin-induced modifications of pre-mRNA splicing and apoptosis. BMC Cancer. 15, (2015).
- Lee, S. C. -. W., Abdel-Wahab, O. Therapeutic targeting of splicing in cancer. Nature Medicine. 22 (9), 976-986 (2016).
- Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37 (4), 331-340 (2005).
- Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing. Brain Research Protocols. 4 (3), 383-394 (1999).
- Zerler, B., et al. Adenovirus E1A coding sequences that enable ras and pmt oncogenes to transform cultured primary cells. Molecular and Cellular Biology. 6 (3), 887-899 (1986).
- Gattoni, R., Schmitt, P., Stevenin, J. In vitro splicing of adenovirus E1A transcripts: characterization of novel reactions and of multiple branch points abnormally far from the 3′ splice site. Nucleic Acids Research. 16 (6), 2389-2409 (1988).
- Stephens, C., Harlow, E. Differential splicing yields novel adenovirus 5 E1A mRNAs that encode 30 kd and 35 kd proteins. The EMBO journal. 6 (7), 2027-2035 (1987).
- Ulfendahl, P. J., et al. A novel adenovirus-2 E1A mRNA encoding a protein with transcription activation properties. The EMBO journal. 6 (7), 2037-2044 (1987).
- Berk, A. J., Sharp, P. A. Structure of the adenovirus 2 early mRNAs. Cell. 14 (3), 695-711 (1978).
- Svensson, C., Pettersson, U., Akusjärvi, G. Splicing of adenovirus 2 early region 1A mRNAs is non-sequential. Journal of Molecular Biology. 165 (3), 475-495 (1983).
- Basei, F. L., Meirelles, G. V., Righetto, G. L., dos Santos Migueleti, D. L., Smetana, J. H. C., Kobarg, J. New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing. Proteome Science. 13 (1), 11 (2015).
- Zhou, Z., et al. The Akt-SRPK-SR Axis Constitutes a Major Pathway in Transducing EGF Signaling to Regulate Alternative Splicing in the Nucleus. Molecular Cell. 47 (3), 422-433 (2012).
- Caceres, J., Stamm, S., Helfman, D., Krainer, A. Regulation of alternative splicing in vivo by overexpression of antagonistic splicing factors. Science. 265 (5179), 1706-1709 (1994).
- Zhong, X. -. Y., Ding, J. -. H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -. D. Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones. Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).
- Naro, C., et al. The centrosomal kinase NEK2 is a novel splicing factor kinase involved in cell survival. Nucleic Acids Research. 42 (5), 3218-3227 (2014).
- Lu, C. -. C., Chen, T. -. H., Wu, J. -. R., Chen, H. -. H., Yu, H. -. Y., Tarn, W. -. Y. Phylogenetic and Molecular Characterization of the Splicing Factor RBM4. PLoS ONE. 8 (3), 59092 (2013).
- Jarnæss, E., et al. Splicing Factor Arginine/Serine-rich 17A (SFRS17A) Is an A-kinase Anchoring Protein That Targets Protein Kinase A to Splicing Factor Compartments. Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 35154-35164 (2009).
- Bressan, G. C., et al. Functional association of human Ki-1/57 with pre-mRNA splicing events. FEBS Journal. 276 (14), 3770-3783 (2009).
- Vivarelli, S., et al. Paraquat Modulates Alternative Pre-mRNA Splicing by Modifying the Intracellular Distribution of SRPK2. PLoS ONE. 8 (4), 61980 (2013).
- Russell, W. C., Graham, F. L., Smiley, J., Nairn, R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5. Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: A simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bai, Y. Control of 3′ splice site choice in vivo by ASF/SF2 and hnRNP A1. Nucleic Acids Research. 27 (4), 1126-1134 (1999).
- Cote, G. J., Nguyen, N., Lips, C. J. M., Berget, S. M., Gagel, R. F. Validation of an in vitro RNA processing system for CT/CGRP precursor mRNA. Nucleic Acids Research. 19 (13), 3601-3606 (1991).
