Établir un système de culture de sphéroïdes épidermiques à haut débit pour modéliser la plasticité des cellules souches kératinocytes
Summary
Nous décrivons ici un protocole pour la culture systématique de sphéroïdes épidermiques en culture en suspension 3D. Ce protocole a de nombreuses applications pour une utilisation dans une variété de types de tissus épithéliaux et pour la modélisation de plusieurs maladies et affections humaines.
Abstract
La dérégulation épithéliale est un nœud pour une variété de conditions et de maux humains, y compris les blessures chroniques, l’inflammation et plus de 80% de tous les cancers humains. En tant que tissu de la muqueuse, l’épithélium cutané est souvent sujet à des blessures et s’est adapté à l’évolution en acquérant la plasticité cellulaire nécessaire pour réparer les tissus endommagés. Au fil des ans, plusieurs efforts ont été déployés pour étudier la plasticité épithéliale à l’aide de modèles cellulaires in vitro et ex vivo. Cependant, ces efforts ont été limités dans leur capacité à récapituler les différentes phases de la plasticité des cellules épithéliales. Nous décrivons ici un protocole pour générer des sphéroïdes épidermiques 3D et des cellules dérivées de sphéroïdes épidermiques à partir de kératinocytes humains néonatals primaires. Ce protocole décrit la capacité des cultures de sphéroïdes épidermiques à modéliser fonctionnellement des stades distincts de la plasticité générative des kératinocytes et démontre que le repoingage des sphéroïdes épidermiques peut enrichir les cultures hétérogéniques normales de kératinocytes humains (NHKc) pour les sous-populations de kératinocytes intégriens (NHKc) pour les sous-populations de kératinocytesintégriens hi/EGFRlo présentant des caractéristiques améliorées semblables à celles de la tige. Notre rapport décrit le développement et le maintien d’un système à haut débit pour l’étude de la plasticité kératinocytaire cutanée et de la régénération épidermique.
Introduction
L’épithélium stratifié des mammifères est l’architecture épithéliale la plus complexe de tous les systèmes vivants et est le plus souvent sujet à des dommages et à des blessures. En tant que tissu protecteur, l’épithélium stratifié a évolué pour générer une réponse complexe et efficace aux lésions tissulaires. En cas de blessure, ces cellules doivent activer des programmes de plasticité de lignée, qui leur permettent de migrer vers le site blessé et d’effectuer des réparations1,2,3. Cette réponse multiforme se produit en plusieurs étapes séquentielles qui restent mal comprises.
Un obstacle majeur dans l’étude du processus complexe de régénération épithéliale réside dans la pénurie de systèmes modèles à haut débit qui peuvent capturer les activités cellulaires dynamiques à des stades définis de la régénération cellulaire. Alors que les modèles murins in vivo offrent des informations pertinentes sur la cicatrisation des plaies et récapitulent le plus fidèlement le processus de régénération humaine, leur développement nécessite des efforts laborieux et des coûts importants, limitant leur capacité de débit. Il existe donc un besoin critique d’établir des systèmes qui permettent l’étude fonctionnelle de la régénération des tissus épithéliaux humains à grande échelle.
Ces dernières années, plusieurs tentatives ont été faites pour relever le défi de l’évolutivité. Cela se voit à travers une grande expansion de modèles cellulaires in vitro et ex vivo innovants qui imitent étroitement le contexte régénératif in vivo. Cela inclut les progrès dans les organes sur puce4,le sphéroïde5,l’organoïde6et les cultures organotypiques7. Ces systèmes à base de cellules 3D offrent chacun des avantages uniques et présentent des limites expérimentales distinctes. À ce jour, la culture sphéroïde reste le modèle de culture cellulaire 3D le plus rentable et le plus utilisé. Et bien que plusieurs rapports aient indiqué que les cultures de sphéroïdes peuvent être utilisées pour étudier les caractéristiques des cellules souches de la peau, ces études ont été menées en grande partie avec des tissus animaux8,9ou avec des fibroblastes dermiques10,sans pratiquement aucun rapport caractérisant de manière approfondie les propriétés régénératrices des cultures de sphéroïdes épidermiques humains. Dans ce protocole, nous détaillons le développement fonctionnel, la culture et le maintien des cultures de sphéroïdes épidermiques à partir de kératinocytes humains normaux (NHKc). Nous décrivons également l’utilité de ce système pour modéliser les phases séquentielles de la régénération épidermique et de la plasticité des cellules souches kératinocytes in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’utilisation de systèmes de culture sphéroïde 3D a eu une grande utilité dans l’évaluation de la souche cellulaire. Il a été démontré que ces systèmes améliorent l’enrichissement des cellules souches tissulaires13, mais leur utilité pour l’étude des cellules souches épidermiques humaines a été peu explorée. Nous décrivons ici une stratégie d’enrichissement des cellules souches kératinocytes humaines à l’aide de techniques de culture 3D. Dans ce système, les NHKc …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’Installation de ressources en instrumentation (IRF) de l’École de médecine de l’Université de S.C. a donné accès à de l’équipement d’imagerie et de tri cellulaire et à une assistance technique. Ce travail a été soutenu en partie par la subvention 1R21CA201853. Le MCF et l’IRF reçoivent un soutien partiel de la subvention P20GM103499 du NIH, SC INBRE. Le MCF reçoit également le soutien de la subvention P20GM109091 des NIH. Yvon Woappi a été soutenu en partie par les subventions 2R25GM066526-06A1 (PREP) et R25GM076277 (IMSD) des NIH, et par une bourse du grace Jordan McFadden Professors Program à l’UofSC. Geraldine Ezeka et Justin Vercellino ont été soutenus par les subventions 2R25GM066526-10A1 (PREP) des NIH à l’Université de La CSI. Sean M. Bloos a été soutenu par le Magellan Scholar Award 2016 à l’UofSC.
Materials
| Affymetrix platform | Affymetrix | For microarray experiments | |
| Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file | Affymetrix | Process | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | For microarray experiments | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | Used for RNA isolation |
| Analysis Console Software version 3.0.0.466 | analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance | ||
| BD FACSAria II flow cytometer | Beckman | For flow cytometry | |
| Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| Cytokeratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | 1:200 dilution |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | For cell media |
| FITC-conjugated anti-integrinα6 | Abcam | ab30496 | For FACS analysis |
| GeneChip Command Console 4.0 software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | |
| GeneChip Hybridization Oven 640 | Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples | |
| GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip Scanner 3000 7G system | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Scanning hybridized arrays | |
| GeneChip WT PLUS Reagent Kit | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For amplifycation of biotinylating total RNA | |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) | Cell Signaling Technology | 8910 | For cell media |
| Human Epidermal Growth Factor (hEGF) | Cell Signaling Technology | 8916 | For cell media |
| Human Insulin | Millipore Sigma | 9011-M | For cell media |
| iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | Bio-Rad | 1708880 | Used for RT-qPCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Used for RT-qPCR |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005041 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| KSFM-scm | ThermoFisher Scientific | 17005042 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| MCDB 153-LB basal medium | Sigma-Aldrich | M7403 | MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer |
| NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS | Stellar Scientific | NST230111 | For immunostaining |
| P63 | Thermo Scientific | 703809 | 1:200 dilution |
| PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) | BD Pharmingen | 555997 | For FACS analysis |
| pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector | Addgene | 20672 | For transfection |
| Promega TransFast kit | Promega | E2431 | For transfection |
| Qiagen RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | For microarray experiments | |
| Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 09-740-63D | For cell media |
| Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope | Zeiss | Use with Axiovision Rel. 4.5 software |
Referências
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