Etablera ett epidermalt sfäroidkultursystem med hög genomströmning för att modellera Keratinocyte stamcellsplastitet
Summary
Här beskriver vi ett protokoll för systematisk odling av epidermala sfäroider i 3D suspension kultur. Detta protokoll har omfattande tillämpningar för användning i en mängd olika epitelvävnadstyper och för modellering av flera mänskliga sjukdomar och tillstånd.
Abstract
Epiteldysreglering är en nod för en mängd olika mänskliga tillstånd och sjukdomar, inklusive kronisk sårning, inflammation och över 80% av alla mänskliga cancerformer. Som fodervävnad är hudepitelet ofta utsatt för skada och har evolutionärt anpassats genom att förvärva den cellulära plasticitet som krävs för att reparera skadad vävnad. Under årens lopp har flera ansträngningar gjorts för att studera epitelplastik med hjälp av in vitro- och ex vivo-cellbaserade modeller. Dessa ansträngningar har dock begränsats i deras förmåga att rekapitulera de olika faserna av epitelcells plasticitet. Vi beskriver här ett protokoll för att generera 3D epidermal sfäroider och epidermal sfäroid-härledda celler från primära neonatal mänskliga keratinocyter. Detta protokoll beskriver kapaciteten hos epidermala sfäroid kulturer att funktionellt modellera distinkta stadier av keratinocyte generativ plasticitet och visar att epidermal sfäroid omplätering kan berika heterogena normala mänskliga keratinocyter (NHKc) kulturer för integrinα6hi/EGFRlo keratinocyte subpopulationer med förbättrade stam-liknande egenskaper. Vår rapport beskriver utveckling och underhåll av ett högt genomströmningssystem för studier av huden keratinocyte plasticitet och epidermal regenerering.
Introduction
Däggdjursstratifierade epitel är den mest komplexa epitelarkitekturen i alla levande system och är oftast föremål för skador och skador. Som skyddande vävnad har stratifierat epitel utvecklats för att generera ett komplext och effektivt vävnadsskada. Vid skada måste dessa celler aktivera härstamningsprogram, vilket gör det möjligt för dem att migrera till den skadade platsen och utföra reparation1,2,3. Detta mångfacetterade svar sker i flera sekventiella steg som förblir dåligt förstådda.
Ett stort hinder för att studera den invecklade processen med epitelregenerering ligger i bristen på modeller med hög genomströmning som kan fånga dynamiska cellulära aktiviteter i definierade stadier av cellregenerering. Medan musmodeller in vivo erbjuder relevant inblick i sårläkning och närmast rekapitulerar den mänskliga regenerativa processen, kräver deras utveckling mödosamma ansträngningar och betydande kostnader, vilket begränsar deras genomströmningskapacitet. Det finns därför ett kritiskt behov av att upprätta system som möjliggör funktionell undersökning av mänsklig epitelvävnadsregenerering i hög genomströmningsskala.
Under de senaste åren har flera försök gjorts för att möta skalbarhetsutmaningen. Detta ses genom stor expansion av innovativa in vitro- och ex vivo-cellbaserade modeller som nära efterliknar in vivo-regenerativa sammanhang. Detta inkluderar framsteg i organ-på-chip4,sfäroid5,organoid6, och organotypiska kulturer7. Dessa 3D-cellbaserade system erbjuder var och en unika fördelar och presenterar distinkta experimentella begränsningar. Hittills är sfäroidkultur fortfarande den mest kostnadseffektiva och allmänt använda 3D-cellkulturmodellen. Och medan flera rapporter har indikerat att sfäroidkulturer kan användas för att studera hudstamcellsegenskaper, har dessa studier till stor del utförts meddjurvävnad 8,9, eller med dermala fibroblaster10, med praktiskt taget inga rapporter som grundligt karakteriserar de regenerativa egenskaperna hos mänskliga epidermala sfäroidkulturer. I detta protokoll beskriver vi funktionell utveckling, kultur och underhåll av epidermala sfäroid kulturer från normala mänskliga keratinocyter (NHKc). Vi beskriver också nyttan av detta system att modellera de sekventiella faserna av epidermal regenerering och keratinocyte stamcells plasticitet in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Användningen av 3D-sfäroidkultursystem har haft stor nytta vid bedömning av cellstamhet. Dessa system har visat sig förbättra anrikningen avvävnad stamceller 13, men deras nytta för studier av mänskliga epidermal stamceller har undersökts begränsat. Här beskriver vi en strategi för berikande mänskliga keratinocyte stamceller med hjälp av 3D kultur tekniker. I detta system odlas NHKc som självmonterande multicellulära sfäroid suspensioner, bestående av flera keratinocyt subtyper u…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
UofSC School of Medicine Instrumentation Resource Facility (IRF) gav tillgång till bildbehandlings- och cellsorteringsutrustning och tekniskt bistånd. Detta arbete stöddes delvis av bidrag 1R21CA201853. MCF och IRF får delvis stöd från NIH-bidrag P20GM103499, SC INBRE. MCF får också stöd från NIH-bidrag P20GM109091. Yvon Woappi stöddes delvis av NIH-bidrag 2R25GM066526-06A1 (PREP) och R25GM076277 (IMSD) och av ett stipendium av Grace Jordan McFadden Professors Program vid UofSC. Geraldine Ezeka och Justin Vercellino stöddes av NIH-bidrag 2R25GM066526-10A1 (PREP) vid UofSC. Sean M. Bloos fick stöd av Magellan Scholar Award 2016 på UofSC.
Materials
| Affymetrix platform | Affymetrix | For microarray experiments | |
| Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file | Affymetrix | Process | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | For microarray experiments | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | Used for RNA isolation |
| Analysis Console Software version 3.0.0.466 | analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance | ||
| BD FACSAria II flow cytometer | Beckman | For flow cytometry | |
| Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| Cytokeratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | 1:200 dilution |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | For cell media |
| FITC-conjugated anti-integrinα6 | Abcam | ab30496 | For FACS analysis |
| GeneChip Command Console 4.0 software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | |
| GeneChip Hybridization Oven 640 | Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples | |
| GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip Scanner 3000 7G system | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Scanning hybridized arrays | |
| GeneChip WT PLUS Reagent Kit | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For amplifycation of biotinylating total RNA | |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) | Cell Signaling Technology | 8910 | For cell media |
| Human Epidermal Growth Factor (hEGF) | Cell Signaling Technology | 8916 | For cell media |
| Human Insulin | Millipore Sigma | 9011-M | For cell media |
| iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | Bio-Rad | 1708880 | Used for RT-qPCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Used for RT-qPCR |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005041 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| KSFM-scm | ThermoFisher Scientific | 17005042 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| MCDB 153-LB basal medium | Sigma-Aldrich | M7403 | MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer |
| NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS | Stellar Scientific | NST230111 | For immunostaining |
| P63 | Thermo Scientific | 703809 | 1:200 dilution |
| PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) | BD Pharmingen | 555997 | For FACS analysis |
| pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector | Addgene | 20672 | For transfection |
| Promega TransFast kit | Promega | E2431 | For transfection |
| Qiagen RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | For microarray experiments | |
| Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 09-740-63D | For cell media |
| Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope | Zeiss | Use with Axiovision Rel. 4.5 software |
Referências
- Patel, G. K., Wilson, C. H., Harding, K. G., Finlay, A. Y., Bowden, P. E. Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization. Journal of Investigative Dermatology. 126 (2), 497-502 (2006).
- Dekoninck, S., Blanpain, C. Stem cell dynamics, migration and plasticity during wound healing. Nature Cell Biology. 21 (1), 18-24 (2019).
- Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within Stratified Epithelial Stem Cell Populations Maintains the Oral Mucosa in Response to Physiological Stress. Cell Stem Cell. , (2019).
- Rothbauer, M., Rosser, J. M., Zirath, H., Ertl, P. Tomorrow today: organ-on-a-chip advances towards clinically relevant pharmaceutical and medical in vitro models. Current Opinion in Biotechnology. 55, 81-86 (2019).
- Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering Multi-Cellular Spheroids for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Advanced Healthcare Materials. , 2000608 (2020).
- Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
- Zhang, Q., et al. Early-stage bilayer tissue-engineered skin substitute formed by adult skin progenitor cells produces an improved skin structure in vivo. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 407 (2020).
- Borena, B. M., et al. Sphere-forming capacity as an enrichment strategy for epithelial-like stem cells from equine skin. Cellular Physiology and Biochemistry. 34 (4), 1291-1303 (2014).
- Vollmers, A., et al. Two- and three-dimensional culture of keratinocyte stem and precursor cells derived from primary murine epidermal cultures. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 402-413 (2012).
- Kang, B. M., Kwack, M. H., Kim, M. K., Kim, J. C., Sung, Y. K. Sphere formation increases the ability of cultured human dermal papilla cells to induce hair follicles from mouse epidermal cells in a reconstitution assay. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 237-239 (2012).
- Woappi, Y., Hosseinipour, M., Creek, K. E., Pirisi, L. Stem Cell Properties of Normal Human Keratinocytes Determine Transformation Responses to Human Papillomavirus 16 DNA. Journal of Virology. 92 (11), (2018).
- Woappi, Y., Altomare, D., Creek, K., Pirisi, L. Self-assembling 3D spheroid cultures of human neonatal keratinocytes have enhanced regenerative properties. Stem Cell Research. , (2020).
- Toma, J. G., McKenzie, I. A., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23 (6), 727-737 (2005).
- Li, F., et al. Loss of the Epigenetic Mark 5-hmC in Psoriasis: Implications for Epidermal Stem Cell Dysregulation. Journal of Investigative Dermatology. , (2020).
- Kuo, C. T., et al. Three-dimensional spheroid culture targeting versatile tissue bioassays using a PDMS-based hanging drop array. Scientific Reports. , (2017).
- Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. GSE94244 – Expression data from normal human spheroid-forming keratinocytes in monolayer mass culture and from corresponding cornified-like spheroid ring structures. Gene Expression Omnibus (GEO). , (2020).
