Utilizzo dell'embrione di pollo come potente strumento nella valutazione delle cardiotossicità dello sviluppo

Summary

Gli embrioni di pollo, come modello di sviluppo classico, vengono utilizzati nel nostro laboratorio per valutare le cardiotossicità dello sviluppo a seguito dell’esposizione a vari contaminanti ambientali. I metodi di esposizione e i metodi di valutazione morfologica/funzionale stabiliti sono descritti in questo manoscritto.

Abstract

Gli embrioni di pollo sono un modello classico negli studi sullo sviluppo. Durante lo sviluppo degli embrioni di pollo, la finestra temporale dello sviluppo del cuore è ben definita ed è relativamente facile ottenere un’esposizione precisa e tempestiva attraverso più metodi. Inoltre, il processo di sviluppo cardiaco negli embrioni di pollo è simile ai mammiferi, risultando anche in un cuore a quattro camere, rendendolo un valido modello alternativo nella valutazione delle cardiotossicità dello sviluppo. Nel nostro laboratorio, il modello dell’embrione di pollo viene utilizzato abitualmente nella valutazione delle cardiotossicità dello sviluppo a seguito dell’esposizione a vari inquinanti ambientali, tra cui sostanze per- e polifluoroalchiliche (PFAS), particolato (PM), gas di scarico diesel (DE) e nano materiali. Il tempo di esposizione può essere liberamente selezionato in base alle necessità, dall’inizio dello sviluppo (giorno embrionale 0, ED0) fino al giorno prima della schiusa. I principali metodi di esposizione includono l’iniezione di cellule aeree, la microiniezione diretta e l’inalazione di cellule aeree (originariamente sviluppate nel nostro laboratorio), e gli endpoint attualmente disponibili includono la funzione cardiaca (elettrocardiografia), la morfologia (valutazioni istologiche) e le valutazioni biologiche molecolari (immunoistochimica, qRT-PCR, western blotting, ecc.). Naturalmente, il modello di embrione di pollo ha i suoi limiti, come la limitata disponibilità di anticorpi. Tuttavia, con più laboratori che iniziano a utilizzare questo modello, può essere utilizzato per dare contributi significativi allo studio delle cardiotossicità dello sviluppo.

Introduction

L’embrione di pollo è un modello di sviluppo classico, che è stato utilizzato per oltre duecento anni¹. Il modello di embrione di pollo ha vari vantaggi rispetto ai modelli tradizionali. Prima di tutto, già oltre 70 anni fa, il normale sviluppo dell’embrione di pollo era stato illustrato molto chiaramente nella guida alla stadiazione Hamburger-Hamilton², in cui un totale di 46 fasi durante lo sviluppo dell’embrione di pollo sono state definite con precise caratteristiche temporali e morfologiche, facilitando il rilevamento di uno sviluppo anormale. Inoltre, il modello di embrione di pollo ha altre caratteristiche come l’essere relativamente a basso costo e ridondante in quantità, controlli relativamente accurati della dose di esposizione, un sistema indipendente e chiuso all’interno del guscio e una facile manipolazione dell’embrione in via di sviluppo, il che garantisce il suo potenziale per essere utilizzato come un potente modello di valutazione tossicologica.

In cardiotossicità, l’embrione di pollo presenta un cuore a quattro camere, simile ai cuori dei mammiferi ma con pareti più spesse, consentendo valutazioni morfologiche più facili. Inoltre, l’embrione di pollo consente l’esposizione per inalazione dello sviluppo, che non è possibile nei modelli di mammiferi: durante la fase successiva dello sviluppo, l’embrione di pollo passerà dalla respirazione interna alla respirazione esterna (ottenendo ossigeno attraverso il polmone); quest’ultimo richiede che l’embrione penetri nella membrana cellulare dell’aria con il becco e inizi a respirare aria³, rendendo la cellula aerea una mini-camera di inalazione. Utilizzando questo fenomeno, gli effetti tossicologici dei contaminanti gassosi sul cuore (e su altri organi) possono essere valutati senza la necessità di strumenti dedicati alla camera di inalazione.

In questo manoscritto sono descritti diversi metodi di valutazione dell’esposizione / endpoint, che servono a rendere l’embrione di pollo un potente strumento nella valutazione della cardiotossicità dello sviluppo a seguito dell’esposizione a contaminanti ambientali.

Protocol

Tutte le procedure descritte sono state approvate dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell’Università di Qingdao. Nel nostro laboratorio, le uova sono state incubate in due incubatrici. Le uova sono state tenute in posizione verticale nell’incubatrice e posizionate casualmente sugli scaffali. Le condizioni di incubazione per le uova erano le seguenti: la temperatura di incubazione è iniziata a 37,9 °C e gradualmente è diminuita a 37,1 °C man mano che procedeva l’incubazione; l’umidità è inizia…

Representative Results

Risultati dell’esposizioneIniezione di celle d’ariaL’iniezione di cellule aeree può esporre efficacemente lo sviluppo di embrioni di pollo a vari agenti, che possono essere successivamente rilevati nei campioni raccolti (siero, tessuto, ecc.) di embrioni / polli da cova. Ecco un esempio, in cui l’acido perfluoroottonico (PFOA) è stato iniettato da cellule d’aria e le concentrazioni sieriche di PFOA sono state quindi determinate con cromatografia liquida ad alte prestazioni-spettrometria di massa. Le concentrazi…

Discussion

L’embrione di pollo è stato un modello classico negli studi sullo sviluppo per 200 anni¹. I nostri metodi presentati in questo manoscritto sono stati utilizzati nella valutazione di diversi contaminanti ambientali, tra cui acido perfluoroottanoico, particolato e gas di scarico diesel con successo^{5,7,8,9,10,…}

Materials

4% phosphate buffered formaldehydefixative	Biosharp, Hefei, China	REF: BL539A
75% ethanol	Guoyao,Shanghai,China	CAS:64-17-5
Biosignaling monitor BL-420E+	Taimeng, Chengdu, China	BL-420E+
Candling lamp	Zhenwei, Dezhou, China	WZ-001
Disposable syringe	Zhiyu, Jiangsu, China
Egg incubator	Keyu,Dezhou, China	KFX
Electrical balance	OHAUS, Shanghai, China	AR 224CN
Electro-thermal incubator	Shenxian, Shanghai, China	DHP-9022
Ethanol absolute	Guoyao,Shanghai,China	CAS:64-17-5
Fertile chicken egg	Jianuo, Jining, China
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	Beyotime, Bejing, China	C0105
Histology paraffin	Aladdin, Shanghai, China	P100928-500g	Melt point 52~54°C
Histology paraffin	Aladdin, Shanghai, China	P100936-500g	Melt point 62~64°C
IV catheter	KDL, Zhejiang, China		The catheters have to be soft, plastic ones.
Lentivirus	Genechem, Shanghai, China		The lentivirus were individually designed/synthesized by Genechem.
Masson's trichrome staining kit	Solarbio, Beijing, China	G1340
Metal probe	Jinuotai, Beijing, China
Microinjector (5 uL)	Anting,Shanghai, China
Microscope	CAIKON, Shanghai, China	XSP-500
Microtome	Leica, Germany	HistoCore BIOCUT
Microtome blade	Leica,Germany	Leica 819
Pentobarbitual sodium	Yitai Technology Co. Ltd.,  Wuhan, China	CAS: 57-33-0
Pipetter(10ul)	Sartorius, Germany
Povidone iodide	Longyuquan, Taian, China
Scissor	Anqisheng,Suzhou, China
Sterile saline	Kelun,Chengdu, China
Sunflower oil	Mighty Jiage, Jiangsu, China		Any commerical sunflower oil for human consumption should work
Tape	M&G, Shanghai, China
Tedlar PVF Bag (5L)	Delin, Dalian, China
Vortex mixer	SCILOGEX, Rocky Hill, CT, US	MX-F
Xylene	Guoyao,Shanghai,China	CAS:1330-20-7