Bruke kyllingembryo som et kraftig verktøy i vurdering av utviklingsmessige kardiotoksisiteter

Summary

Kyllingembryoer, som en klassisk utviklingsmodell, brukes i laboratoriet vårt for å vurdere utviklingsmessige kardiotoksisiteter etter eksponering for ulike miljøgifter. Eksponeringsmetoder og morfologiske/funksjonelle vurderingsmetoder som er etablert er beskrevet i dette manuskriptet.

Abstract

Kyllingembryoer er en klassisk modell i utviklingsstudier. Under utviklingen av kyllingembryoer er tidsvinduet for hjerteutvikling veldefinert, og det er relativt enkelt å oppnå presis og rettidig eksponering via flere metoder. Videre er prosessen med hjerteutvikling i kyllingembryoer lik pattedyr, noe som også resulterer i et firekammeret hjerte, noe som gjør det til en verdifull alternativ modell i vurderingen av utviklingsmessige kardiotoksisiteter. I laboratoriet vårt brukes kyllingembryomodellen rutinemessig i vurderingen av utviklingsmessige kardiotoksisiteter etter eksponering for ulike miljøgifter, inkludert per- og polyfluoroalkyle stoffer (PFAS), svevestøv (PMs), dieseleksos (DE) og nanomaterialer. Eksponeringstiden kan velges fritt basert på behovet, fra begynnelsen av utviklingen (embryonal dag 0, ED0) helt til dagen før luke. De viktigste eksponeringsmetodene inkluderer luftcelleinjeksjon, direkte mikroinjeksjon og luftcelleinnånding (opprinnelig utviklet i laboratoriet vårt), og de tilgjengelige endepunktene inkluderer hjertefunksjon (elektrokardiografi), morfologi (histologiske vurderinger) og molekylære biologiske vurderinger (immunohistokjemi, qRT-PCR, vestlig blotting, etc.). Selvfølgelig har kyllingembryomodellen sine egne begrensninger, for eksempel begrenset tilgjengelighet av antistoffer. Likevel, med flere laboratorier som begynner å bruke denne modellen, kan den brukes til å gi betydelige bidrag til studiet av utviklingsmessige kardiotoksisiteter.

Introduction

Kyllingembryoet er en klassisk utviklingsmodell, som har blitt brukt i over to hundre år¹. Kyllingembryomodellen har forskjellige fordeler sammenlignet med tradisjonelle modeller. Først av alt, så tidlig som for over 70 år siden, hadde den normale utviklingen av kyllingembryoet blitt illustrert veldig tydelig i Hamburger-Hamilton iscenesettelsesguide², der totalt 46 stadier under kyllingembryoutvikling ble definert med presis tid og morfologiske egenskaper, noe som letter deteksjon av unormal utvikling. I tillegg har kyllingembryomodellen andre funksjoner som å være relativt lavkostnads og overflødig i mengde, relativt nøyaktige eksponeringsdosekontroller, et uavhengig, lukket system i skallet og enkel manipulering av det utviklende embryoet, som alle garanterer sitt potensial til å bli brukt som en kraftig toksikologiske vurderingsmodell.

Ved kardiotoksisitet har kyllingembryoet et firekammeret hjerte, som ligner pattedyrhjerter, men med tykkere vegger, noe som gir lettere morfologiske vurderinger. I tillegg tillater kyllingembryoet utviklingsinhalasjonseksponering, noe som ikke er mulig i pattedyrmodeller: i løpet av det senere utviklingsstadiet vil kyllingembryoet gå over fra intern åndedrett til ekstern åndedrett (få oksygen via lungen); sistnevnte krever at embryoet trenger inn i luftcellemembranen med nebbet, og begynner å puste luft³, noe som gjør luftcellen til et miniinnåndingskammer. Ved hjelp av dette fenomenet kan de toksikologiske effektene av gassforurensninger på hjertet (og andre organer) vurderes uten behov for dedikerte innåndingskammerinstrumenter.

I dette manuskriptet beskrives flere vurderingsmetoder for eksponering/endepunkt, som alle tjener til å gjøre kyllingebryoet til et kraftig verktøy i vurderingen av utviklings kardiotoksisitet etter eksponering for miljøgifter.

Protocol

Alle prosedyrer som er beskrevet ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Qingdao University. I laboratoriet vårt ble eggene inkubert i to inkubatorer. Egg ble holdt oppreist i inkubatoren og tilfeldig plassert på hyllene. Inkubasjonsforholdene for eggene var som følger: inkubasjonstemperaturen startet ved 37,9 °C, og ble gradvis redusert til 37,1 °C etter hvert som inkubasjonen fortsatte; fuktigheten startet på 50% og økte gradvis til 70%. 1. Eksponeringsme…

Representative Results

Resultater av eksponeringInjeksjon av luftcellerLuftcelleinjeksjon kan effektivt utsette utvikling av kyllingembryoer til ulike midler, som senere kan oppdages i de innsamlede prøvene (serum, vev, etc.) av embryoer / hatchling kyllinger. Her er et eksempel, der perfluorooctanoic acid (PFOA) ble luftcelle injisert, og serum PFOA konsentrasjoner ble deretter bestemt med Ultra-ytelse flytende kromatografi-masse spektrometri. Serumkonsentrasjonene korresponderte med de injiserte dosene, noe som indikerer effektivite…

Discussion

Kyllingembryoet har vært en klassisk modell i utviklingsstudier i 200 år¹. Våre metoder presentert i dette manuskriptet har blitt brukt i vurderingen av flere miljøgifter, inkludert perfluorooctanoic acid, svevestøv og dieseleksos med suksess^{5,7,8,9,10,11,12}. Med…

Materials

4% phosphate buffered formaldehydefixative	Biosharp, Hefei, China	REF: BL539A
75% ethanol	Guoyao,Shanghai,China	CAS:64-17-5
Biosignaling monitor BL-420E+	Taimeng, Chengdu, China	BL-420E+
Candling lamp	Zhenwei, Dezhou, China	WZ-001
Disposable syringe	Zhiyu, Jiangsu, China
Egg incubator	Keyu,Dezhou, China	KFX
Electrical balance	OHAUS, Shanghai, China	AR 224CN
Electro-thermal incubator	Shenxian, Shanghai, China	DHP-9022
Ethanol absolute	Guoyao,Shanghai,China	CAS:64-17-5
Fertile chicken egg	Jianuo, Jining, China
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	Beyotime, Bejing, China	C0105
Histology paraffin	Aladdin, Shanghai, China	P100928-500g	Melt point 52~54°C
Histology paraffin	Aladdin, Shanghai, China	P100936-500g	Melt point 62~64°C
IV catheter	KDL, Zhejiang, China		The catheters have to be soft, plastic ones.
Lentivirus	Genechem, Shanghai, China		The lentivirus were individually designed/synthesized by Genechem.
Masson's trichrome staining kit	Solarbio, Beijing, China	G1340
Metal probe	Jinuotai, Beijing, China
Microinjector (5 uL)	Anting,Shanghai, China
Microscope	CAIKON, Shanghai, China	XSP-500
Microtome	Leica, Germany	HistoCore BIOCUT
Microtome blade	Leica,Germany	Leica 819
Pentobarbitual sodium	Yitai Technology Co. Ltd.,  Wuhan, China	CAS: 57-33-0
Pipetter(10ul)	Sartorius, Germany
Povidone iodide	Longyuquan, Taian, China
Scissor	Anqisheng,Suzhou, China
Sterile saline	Kelun,Chengdu, China
Sunflower oil	Mighty Jiage, Jiangsu, China		Any commerical sunflower oil for human consumption should work
Tape	M&G, Shanghai, China
Tedlar PVF Bag (5L)	Delin, Dalian, China
Vortex mixer	SCILOGEX, Rocky Hill, CT, US	MX-F
Xylene	Guoyao,Shanghai,China	CAS:1330-20-7