Estimativa de nanocristais urinários em humanos usando rotulagem fluorófora de cálcio e análise de rastreamento de nanopartículas

Resumo

O objetivo deste estudo foi determinar se a análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) poderia detectar e quantificar o cálcio urinário contendo nanocristais de adultos saudáveis. Os achados do presente estudo sugerem que a NTA pode ser uma ferramenta potencial para estimar os nanocristais urinários durante a doença da pedra nos rins.

Resumo

As pedras nos rins estão se tornando mais prevalentes em todo o mundo em adultos e crianças. O tipo mais comum de pedra renal é composto por cristais de oxalato de cálcio (CaOx). A cristalúria ocorre quando a urina fica supersaturada com minerais (por exemplo, cálcio, oxalato, fosfato) e precede a formação de pedra nos rins. Os métodos padrão para avaliar cristais em pretos de pedra incluem microscopia, filtração e centrifugação. No entanto, esses métodos detectam principalmente microcristais e não nanocristais. Nanocristais têm sido sugeridos como mais prejudiciais às células epiteliais renais do que microcristais in vitro. Aqui, descrevemos a capacidade da análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) de detectar nanocristais urinários humanos. Adultos saudáveis foram alimentados com uma dieta oxala controlada antes de beber uma carga de oxalato para estimular os nanocristais urinários. A urina foi coletada por 24 horas antes e depois da carga de oxalato. As amostras foram processadas e lavadas com etanol para purificar amostras. Os nanocristais urinários foram manchados com o fluorophore de ligação de cálcio, Fluo-4 AM. Após a coloração, o tamanho e a contagem de nanocristais foram determinados por meio da NTA. Os achados deste estudo mostram que a NTA pode detectar de forma eficiente a nanocristaria em adultos saudáveis. Esses achados sugerem que a NTA pode ser um valioso método de detecção precoce de nanocristaria em pacientes com doença de pedra renal.

Introdução

Cristais urinários se formam quando a urina fica supersaturada com minerais. Isso pode ocorrer em indivíduos saudáveis, mas é mais comum em indivíduos com pedras nos rins¹. A presença e o acúmulo de cristais urinários podem aumentar o risco de desenvolver uma pedra nos rins. Especificamente, isso ocorre quando cristais se ligam à placa de Randall, nuclear, acumular e crescer ao longo do tempo^2,3,4. Cristais precedem a formação de pedra nos rins e a avaliação da cristalúria pode ter valor preditivo em ex-pedras renais^3,

Protocolo

Todos os experimentos descritos neste trabalho foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade do Alabama em Birmingham (UAB). Adultos saudáveis (33,6 ± 3,3 anos; n=10) foram inscritos no estudo se tivessem um painel metabólico normal e abrangente, usuários não-tabaco, não gestantes, um IMC entre 20-30 kg/m², e livres de condições médicas crônicas ou doenças agudas. Os participantes saudáveis assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido por escrito antes do início do estudo.

1. Protocolo clínico e coleta de urina

1. Os participantes consomem uma dieta de baixo oxalato preparada pelo Núcleo....

Resultados

Os achados deste estudo mostram que a NTA pode detectar eficientemente o tamanho médio e a concentração de cálcio contendo nanocristais urinários na urina humana. Isso foi conseguido utilizando-se a análise de rastreamento de fluoforas, Fluo-4 AM e nanopartículas. Fluo-4 AM foi capaz de se ligar tanto aos cristais CaOx quanto aos cap. Como mostrado na Figura 3A,os cristais caOx foram determinados entre 50-270 nm de tamanho e têm uma concentração média de 1,26 x 10⁹ partículas/mL. .......

Discussão

A NTA tem sido utilizada no presente estudo para avaliar nanocristais na urina humana usando uma sonda de ligação de cálcio, Fluo-4 AM. Não há um método padrão disponível para detectar nanocristais na urina. Alguns grupos de pesquisa detectaram nanocristais na urina e se basearam no uso de protocolos ou métodos extensos que são limitados em sua capacidade de quantificar as amostras^27,28. Este estudo mostra um método específico e sensível para detectar cálcio cont.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Centrífuga de bancada Centrífuga	Jouan	CR3-12
Oxalato de cálcio monohidratado	Sintetizado em laboratório conforme descrito anteriormente29.		Loja na RT; Estoque de cristais de fosfato de cálcio de 10 mM
(nanopó de hidroxiapatita)	Sigma	677418	Armazenar na RT; Estoque de etanol de 10 mM
	Fischer Scientific	AC615095000	Store na RT; Estoque 100%
Fluo-4 AM *	AAT Bioquest, Inc.	20550	Armazenar no Freezer (-20° C); Estoque de 5 mM
Nanopartículas de Ouro	Sigma	742031	Armazenar em 2-8° C
NanoSight Instrument	Malvern Instruments, Reino Unido	NS300
Bomba de seringa	Harvard Apparatus	98-4730
Virkon Disinfectant	LanXESS Energizing Company, Alemanha	LSP
* Os corantes de fluorescência são sensíveis à luz; estoque e alíquotas devem ser armazenados no escuro a -20 ° C.