De beskrevne protokoller indeholder en guide til at visualisere og kvantificere aktiviteten af neutrofile proteaser i menneskeligt spyt. Anvendelsen af en sådan analyse spænder fra evaluering af antiinflammatoriske behandlinger til biomarkørvalidering, lægemiddelscreening og store kliniske kohorteundersøgelser.
Proteaser er regulatorer af utallige fysiologiske processer, og den præcise undersøgelse af deres aktiviteter er fortsat en spændende biomedicinsk udfordring. Blandt de ~ 600 proteaser kodet af det menneskelige genom, neutrofile serin proteaser (NSP’er) undersøges grundigt for deres engagement i starten og progression af inflammatoriske tilstande, herunder luftvejssygdomme. Unikt udskilles NSP’er ikke kun diffus inden for ekstracellulære væsker, men også lokalisere til plasmamembraner. Under neutrofil ekstracellulær fælde (NETs) dannelse bliver NSP’er en integreret del af den udskillede kromatine. En sådan kompleks adfærd gør forståelsen af NSP’er patofysiologi til en udfordrende opgave. Her er detaljerede protokoller vist sig at visualisere, kvantificere og diskriminere fri og membran-bundet neutrofil elastase (NE) og cathepsin G (CG) aktiviteter i spytprøver. NE og CG er NSP’er, hvis aktiviteter har pleiotropiske roller i patogenese af cystisk fibrose (CF) og kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL): de fremmer vævsfornyelse, regulerer downstream immunrespons og korrelerer med lungesygdom sværhedsgrad. Protokollerne viser, hvordan man kan adskille væske og cellulære fraktion, samt isolering af neutrofiler fra menneskelige spyt for enzymatisk aktivitet kvantificering via små-molekyle Förster resonans energioverførsel-baserede (FRET) reportere. For at indsamle specifik indsigt i den relative rolle, som NE- og CG-aktiviteter spiller, kan en FRET-udlæsning måles ved hjælp af forskellige teknologier: i) målinger af in vitro-pladelæsere giver mulighed for høj gennemløb og massedetektion af proteaseaktivitet; ii) konfokal mikroskopiforeholdelsesspuratorisk forløser membranbundet aktivitet på celleoverfladen iii) små-molekyle FRET flow cytometry gør det muligt for hurtig evaluering af anti-inflammatoriske behandlinger via encellet protease aktivitet kvantificering og fænotyping. Implementeringen af sådanne metoder åbner dørene for at udforske NSP’er patobiologi og deres potentiale som biomarkører for sygdoms sværhedsgrad for CF og KOL. I betragtning af deres standardiseringspotentiale, deres robuste udlæsning og enkelhed i overførslen kan de beskrevne teknikker straks deles til implementering på tværs af forsknings- og diagnoselaboratorier.
Neutrofil elastase (NE), cathepsin G (CG), proteinase 3 (PR3) og neutrofil serin protease 4 (NSP4) er de fire neutrofile serinproteaser (NSP)1. De opbevares sammen med myeloperoxidase inden for neutrofile primære eller azurofile granulater. På grund af deres forhøjede proteolytiske indhold er udskillelsen af primære granulater stramt reguleret, og neutrofiler skal sekventielt udfordres med grunding og aktivering af stimuli2.
Inde i fagagolysse fungerer NSP’er som intracellulære baktericide midler3. Når udskilles, bliver NSP’er stærke formidlere af betændelse: de kløver cytokiner og overfladereceptorer og aktiverer parallelle proinflammatoriske veje3. Det er vigtigt, inflammatoriske tilstande har en ukontrolleret NSP’er sekretion. For eksempel forårsager overdreven NE-aktivitet inden for betændte luftveje slimhypersecretion, bægerceller metaplasi, CFTR-inaktivering og ekstracellulær matrixombygning4,5. Cathepsin G deltager også i inflammation: det kløver specifikt og aktiverer to komponenter i IL-1-familien, IL-36α og IL-36β6. I samråd med NE, CG kløver protease-aktiverede receptorer på luftvejene epitel og aktiverer også TNF-α og IL-1β.
Endogene antiproteaser som alfa-1-antitrypsin, alpha-1-antichymotrypsin og sekretorisk leukocyt protease-hæmmer regulerer neutrofil elastase og cathepsin G-aktivitet5. Men i løbet af lungesygdomsprogression overstiger den kontinuerlige sekretion af proteaser stoichiometrisk anti-proteaseskjoldet, hvilket fører til ikke-opløsende neutrofili i luftvejene, betændelse forværres og vævsskader5,7. Selv om NE koncentration og aktivitet i opløselige fraktioner af patientens luftveje har vist sig at være en lovende biomarkør af sygdommen sværhedsgrad8, NE og CG også knytte sig til neutrofil plasmamembran og ekstracellulære DNA via elektrostatiske interaktioner 9 ,10, hvor deblivermindre tilgængelige for anti-proteaser. Det er vigtigt , at prækliniske undersøgelser definerede et scenario , hvor celleoverfladerelateret proteaseaktivitet forekommer tidligere og/eller uafhængigt af dens opløselige modstykke4,11. Faktisk, at blive påviselig, gratis protease aktivitet først nødt til at overvælde anti-protease skjold. I stedet forbliver membranbundet proteaseaktivitet ved celleoverfladen i det mindste delvist intakt på grund af utilgængeligheden af store hæmmere til celleplasmamembranen12. En sådan kompleks protease adfærd har vigtige konsekvenser for neutrofil-medieret inflammation debut og formering, og derfor skal undersøges med præcise og informative værktøjer.
I årenes løb fandt Förster resonansenergioverførsel (FRET)-baserede sonder adskillige biomedicinske anvendelser som værktøjer, der effektivt og hurtigt vurderer en specifik proteaseaktivitet i menneskelige prøver13. For at fungere består protease-journalister af et anerkendelsesmotiv (dvs. en peptid), som genkendes af målenzymet og er afhængige af FRET, en fysisk proces, hvor en donorfluorophore ved excitation overfører energi til et acceptormolekyle. Den behandling, som enzym drives af journalisten, nemlig genkendelsesdelens kavalergang, resulterer i, at acceptoren diffunderer væk fra donoren: Enzymaktiviteten måles derfor som en tidsafhængig ændring i donoren over acceptor fluorescens. En sådan udlæsning er selvnormaliserende og ratiometrisk, og derfor kun marginalt påvirket af miljøforhold som pH og lokal sondekoncentration. NEmo-114 og sSAM15 er FRET sonder, der rapporterer specifikt om NE og CG aktivitet, henholdsvis. Imidlertid lokaliserer sådanne journalister ikke specifikt til noget cellulært rum, derfor er de ansat til at overvåge proteaseaktiviteten, der er til stede i menneskelige væsker. For at overvåge proteaseaktivitet på en rumlig lokaliseret måde udviklede vi og andre FRET-sonder, der forbinder subcellulære komponenter via molekylære tags14,15,16,17,18,19. En sådan syntetisk strategi gjorde det muligt at udvikle NEmo-2 og mSAM, to FRET-sonder udstyret med lipidankre, der lokaliserer plasmamembranen. Disse journalister næret en dybere forståelse af NE og CG proteaser i cystisk fibrose og kronisk obstruktiv lungesygdomme14,15.
Her er der fastsat detaljerede protokoller for visualisering og kvantificering af opløselige og membranbundne NE- og CG-aktiviteter i humant spyt ved hjælp af NEmo- og SAM-serier af FRET-sonder. For at behandle forskellige aspekter af NSP’ers patofysiologi og tilvejebringe en række metoder, der kan anvendes i henhold til det brugerspecifikke behov, vises analysen via fluorescensspektroskopi, fluorescensmikroskopi og flowcytometik.
De rapporterede protokoller forklarer forskellige tilgange til at kvantificere aktiviteten af neutrofil elastase og cathepsin G i humane spytprøver. Kritiske punkter for en vellykket måling af enzymaktivitet er den i) præcise timing og standardisering af den operative procedure og ii) brugen af pålidelige negative og positive kontroller. Hvis disse betingelser er opfyldt, er de beskrevne metoder ikke begrænset til spyt, men kan også let tilpasses analysen af proteaseaktivitet i blod, bronchoalveolar lavagevæsker og vævssektioner eller homogenater.
Hver af de tre teknikker har sine styrker og begrænsninger, som ofte supplerer hinanden. For eksempel giver flowcytometry mulighed for hurtig analyse af sjældne cellepopulationer samt cellefenotyping, men mangler rumlig opløsningsinformation, som kan opnås ved mikroskopi. I stedet giver pladelæsermålinger mulighed for parallel vurdering af flere prøver eller forhold på en højgennemstrømningshastighed. Da friske spytceller ikke kan fryses og opbevares, kræver de tre metoder, at prøverne skal behandles hurtigt efter ekspektoration. Dette begrænser fleksibiliteten eller gennemløbet af de membranbundne aktivitetsmålinger. Udviklingen af en flow cytometry protokol, der gør det muligt at fastsætte celler efter sonde tilsætning og enzymatisk kavalergang ville åbne for parallel måling af et højere antal rør. Desuden bør der lægges særlig vægt på håndtering og opbevaring af FRET-sonderne. Faktisk gennemgår nogle aminosyrer, der er til stede i peptidsubstratet, såsom methionin, oxidation, hvilket fører til nedsat reporterfølsomhed. For at øge reporterens holdbarhed (anslået til ca. tre måneder ved 20 °C) kan de opbevares i små volumenfoder (1-2 μL) under inert gas som nitrogen eller argon.
I CF og andre kroniske inflammatoriske lungesygdomme er det vigtigt at opdage betændelsen så tidligt som muligt, og pålidelige biomarkører har potentialet til at nå et sådant mål. Muligheden for at opdage overfladebundne NSP’ers aktivitet, som har vist sig at være skadelig for det omgivende væv, også under forhold, hvor der ikke er nogen eller lidt fri NE-aktivitet, tilføjer et andet niveau af værdifuld information, som næppe kan opnås ved hjælp af andre eksisterende metoder4,11.
Journalisterne kan bruges til at studere forbindelsen mellem membran-bundet forbundet NSP aktivitet med sværhedsgrad og progression af lungesygdom, især ved sin tidlige debut. Metoderne kan anvendes til at overvåge behandlingseffektiviteten (f.eks. antiinflammatoriske behandlinger eller meget effektive CFTR-modulatorer og potentiatorer28) og undersøge den deraf følgende dæmpning af neutrofil-drevet inflammation. Derudover er protokollerne baseret på ikke-invasive prøveprocedurer, som indebærer meget lav risiko for patienten og derfor kan bruges i meget bred skala og åbne dørene til mange spændende applikationer.
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt blev støttet af tilskud fra det tyske ministerium for undervisning og forskning (FKZ 82DZL004A1 til M.A.M) og den tyske forskningsfond (SFB-TR84TP B08 til M.A.M). Det arbejde, der er beskrevet i dette manuskript, blev støttet af det tyske Center for Lungeforskning (DZL) og EMBL Heidelberg gennem et ph.d.-stipendium til M.G. Vi takker J. Schatterny, S. Butz og H. Scheuermann for ekspert teknisk bistand.
100 µm Nylon cell strainer | Corning Inc. | 431752 | |
2300 EnSpire (Multilabel Plate Reader) | PerkinElmer | ||
35x10mm Dish, Nunclon Delta | Thermo Fisher Scientific | 150318 | |
40 µm Nylon cell strainer | Corning Inc. | 431750 | |
50 mL tubes | Sarstedt | 10535253 | |
7-AAD, viability dye | Bio Legend | 420404 | 5 µL/100 µL |
Balance | OHAUS Instruments (Shanghai) Co., Ltd. | PR124 | |
BD Falcon Round-Bottom Tubes 5 mL | BD Bioscience | 352054 | |
BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | ||
black flat bottom 96 well half area plate | Corning Life Science | 3694 | |
Cathepsin G | Elastin Products Company | SG623 | |
Cathepsin G Inhibitor I | Merck KGaA | 219372 | |
Centrifuge 5418R | Eppendorf AG | EP5401000137 | |
Combitips advanced 1.0 mL | Eppendorf AG | 0030 089 430 | |
cOmplete proteinase inhibitor | Roche | 11697498001 | |
Countig chambers improved Neubauer | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442 | |
coverslips Ø 25mm | Thermo Fisher Scientific | MENZCB00250RA003 | |
Cytospin 4 | Thermo Fisher Scientific | ||
DRAQ5 (nuclear stain) | BioStatus Limited | DR50050 | 1:10000 |
FACSDiva software, v8.0.1 | BD Bioscience | ||
FcBlock | BD Bioscience | 564219 | |
Fiji (Fiji Is Just ImageJ) | fiji.sc | ||
Flow Jo software, v10 | TreeStar | ||
FluoQ Plugin, v3-97 | |||
Heraeus Megafuge 16R | Thermo Fisher Scientific | ||
Human Sputum Leucocyte Elastase | Elastin Products Company | SE563 | |
Leica SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
Mini Rock-Shaker | PEQLAB Biotechnologie GmbH | MR-1 | |
mouse anti-human CD14, Pe-Cy7, clone M5E2 | BD Bioscience | 557742 Lot:8221983 | 1:50 |
mouse anti-human CD16, AF700, clone 3G8 | BD Bioscience | 557820 Lot:8208791 | 1:50 |
mouse anti-human CD45, APC-Cy7, clone 2D1 | BD Bioscience | 557833 Lot:8059688 | 1:33 |
mouse anti-human CD66b, PE/Dazzel 594, clone G10F5 | BioLegend | 305122 Lot:B241921 | 1:50 |
mSAM | in house | 2 mM | |
Multipette plus | Eppendorf AG | ||
NEmo-1 | SiChem | SC-0200 | 1 mM |
NEmo-2E | SiChem | SC-0201 | 2 mM |
Pari Boy SX with an LC Sprint jet nebulizer | Pari | 085G3001 | |
phosphate buffered saline | Gibco | 10010-015 | |
ROTI Histokitt (mounting medium) | Carl Roth GmbH + Co.KG | 6638.1 | |
Salbutamol | Teva GmbH | ||
Sivelestat | Cayman Chemicals | 17779 | |
Sputolysin | Calbiochem | 560000-1SET | |
sSAM | in house | 2 mM | |
SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | 10149870 | |
Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |