यहां वर्णित प्रोटोकॉल मानव थूक में न्यूट्रोफिल प्रोटेसेस की गतिविधि की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक गाइड प्रदान करते हैं। इस तरह के विश्लेषण के अनुप्रयोगों विरोधी भड़काऊ उपचार के मूल्यांकन से अवधि, बायोमार्कर सत्यापन, दवा स्क्रीनिंग और बड़े पलटन नैदानिक अध्ययन के लिए ।
प्रोटेस अनगिनत शारीरिक प्रक्रियाओं के नियामक हैं और उनकी गतिविधियों की सटीक जांच एक पेचीदा जैव चिकित्सा चुनौती बनी हुई है। मानव जीनोम द्वारा एन्कोड किए गए ~ 600 प्रोटेस में, न्यूट्रोफिल सेरीन प्रोटीज (एनएसएस) को श्वसन रोगों सहित भड़काऊ स्थितियों की शुरुआत और प्रगति में उनकी भागीदारी के लिए अच्छी तरह से जांच की जाती है। विशिष्ट रूप से, स्रावित एनएसएप्स न केवल बाह्राश तरल पदार्थों के भीतर फैलाना बल्कि प्लाज्मा झिल्ली के लिए भी स्थानीयकरण करते हैं। न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप (एनईटी) गठन के दौरान, एनएसएप्स स्रावित क्रोमेटिन का एक अभिन्न हिस्सा बन जाते हैं। इस तरह के जटिल व्यवहार NSPs रोगविज्ञान की समझ एक चुनौतीपूर्ण काम प्रदान करता है । यहां, विस्तृत प्रोटोकॉल थूक के नमूनों में स्वतंत्र और झिल्ली से बंधे न्यूट्रोफिल इलास्टेज (एनई) और कैथेप्सिन जी (सीजी) गतिविधियों की कल्पना, मात्रा और भेदभाव करने के लिए दिखाए गए हैं। एनई और सीजी एनएसएपी हैं जिनकी गतिविधियों में सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) और क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज (सीओपीडी) के रोगजनन में प्लियोट्रोपिक भूमिकाएं होती हैं: वे ऊतक रीमॉडलिंग को बढ़ावा देते हैं, डाउनस्ट्रीम प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को विनियमित करते हैं और फेफड़ों की बीमारी की गंभीरता से सहसंबंधित होते हैं। प्रोटोकॉल दिखाते हैं कि तरल पदार्थ और सेलुलर अंश को कैसे अलग किया जाए, साथ ही छोटे अणु फॉस्टर प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण आधारित (FRET) संवाददाताओं के माध्यम से एंजाइमेटिक गतिविधि मात्राकरण के लिए मानव थूक से न्यूट्रोफिल का अलगाव कैसे किया जाए। एनई और सीजी गतिविधियों की सापेक्ष भूमिका में विशिष्ट अंतर्दृष्टि इकट्ठा करने के लिए, एक FRET readout विभिन्न प्रौद्योगिकियों द्वारा मापा जा सकता है: i) इन विट्रो प्लेट रीडर माप उच्च-थ्रूपुट और प्रोटीज गतिविधि के थोक का पता लगाने की अनुमति देते हैं; ii) कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी स्पेटियोटम्पोरली कोशिका की सतह पर झिल्ली-बाध्य गतिविधि को हल करता है; iii) छोटे-अणु FRET प्रवाह साइटोमेट्री एकल-कोशिका प्रोटीज गतिविधि क्वांटिफिकेशन और फेनोटाइपिंग के माध्यम से विरोधी भड़काऊ उपचारों के तेजी से मूल्यांकन के लिए सक्षम बनाता है। इस तरह के तरीकों का कार्यान्वयन एनएसएपी रोगविज्ञान और सीएफ और सीओपीडी के लिए रोग गंभीरता के बायोमार्कर के रूप में उनकी क्षमता का पता लगाने के लिए दरवाजे खोलता है। उनकी मानकीकरण क्षमता, उनके मजबूत readout और हस्तांतरण की सादगी को देखते हुए, वर्णित तकनीकों को अनुसंधान और नैदानिक प्रयोगशालाओं में कार्यान्वयन के लिए तुरंत साझा किया जा सकता है।
न्यूट्रोफिल इलास्टेज (एनई), कैथेप्सिन जी (सीजी), प्रोटीनेज 3 (पीआर 3) और न्यूट्रोफिल सेरीन प्रोटीज 4 (एनएसपी4) चार न्यूट्रोफिल सेरीन प्रोटेसेस (एनएसएप्स)1हैं । उन्हें न्यूट्रोफिल प्राइमरी या अजूरोफिलिक कणिकाओं के भीतर माइलोप्रोक्सिडेस के साथ संग्रहित किया जाता है। उनकी श्रेष्ठ प्रोटेओलिटिक सामग्री के कारण, प्राथमिक कणिकाओं का स्राव कसकर विनियमित होता है और न्यूट्रोफिल को उत्तेजक औरउत्तेजनाओंको सक्रिय करने के साथ क्रमिक रूप से चुनौती दी जानी चाहिए।
फागोलिसोमेसोम के अंदर, एनएसएप्स इंट्रासेलर बैक्टीरियिसाइडल एजेंटों के रूप में कार्य करते हैं3। जब स्रावित किया जाता है, तो एनएसएपी सूजन के मजबूत मध्यस्थ बन जाते हैं: वे साइटोकिन्स और सतह रिसेप्टर्स को क्लीव करते हैं, समानांतर समर्थक भड़काऊरास्ते 3को सक्रिय करते हैं। महत्वपूर्ण बात, भड़काऊ स्थितियों में एक अनियंत्रित एनएसएप्स स्राव की सुविधा है। उदाहरण के लिए, सूजन वाले वायुमार्ग के भीतर, अत्यधिक एनई गतिविधि बलगम हाइपरसेक्रेशन, गोबलेट कोशिकाओं मेटाप्लासिया, सीएफटीआर निष्क्रियता और बाह्य मैट्रिक्स रिमॉडलिंग4, 5का कारणबनतीहै। कैथेप्सिन जी सूजन में भी भाग लेता है: यह विशेष रूप से आईएल-1 परिवार, आईएल-36α और आईएल-36ο6के दो घटकों को विशेष रूप से क्लीव्स और सक्रिय करता है। एनई के साथ संगीत कार्यक्रम में, सीजी क्लीव्स प्रोटीज-एयरवे एपिथेलियम पर सक्रिय रिसेप्टर्स और टीएनएफ-α और आईएल-11 को भी सक्रिय करता है।
अंतर्जात एंटी-प्रोटीज जैसे अल्फा-1-एंटीट्रीप्सिन, अल्फा-1-एंटीकिमोट्रीप्सिन और सीक्रेटरी ल्यूकोसिटे प्रोटीज अवरोधक न्यूट्रोफिल इलास्टेस और कैथेप्सिन जी गतिविधि5को विनियमित करते हैं। हालांकि, फेफड़ों की बीमारी की प्रगति के दौरान, प्रोटीज का निरंतर स्राव एंटी-प्रोटीज़ शील्ड को stoichiometrically से अधिक हो जाता है, जिससे वायुमार्ग में न्यूट्रोफिलिया को हल न किया जाता है, सूजन बिगड़ती है और ऊतक क्षति5,7। यद्यपि रोगी वायुमार्ग के घुलनशील अंशों में एनई एकाग्रता और गतिविधि को रोग गंभीरता8का एक आशाजनक बायोमार्कर दिखाया गया है, एनई और सीजी भी न्यूट्रोफिल प्लाज्मा झिल्ली से संबद्ध हैं और इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन9,10 के माध्यम से बाह्य डीएनए के लिए हैं जहां वे एंटी-प्रोटीज के लिए कम सुलभ हो जाते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि प्रीक्लिनिकल अध्ययनों ने एक परिदृश्य को परिभाषित किया जहां कोशिका सतह से जुड़ी प्रोटीज गतिविधि पहले दिखाई देती है और/या अपने घुलनशील समकक्ष4,11से स्वतंत्र रूप से । वास्तव में, पता लगाने योग्य बनने के लिए, मुफ्त प्रोटीज़ गतिविधि को पहले एंटी-प्रोटीज़ शील्ड को अभिभूत करने की आवश्यकता होती है। इसके बजाय, कोशिका की सतह पर, झिल्ली से बंधे प्रोटीज गतिविधि सेल प्लाज्मा झिल्ली12के लिए बड़े अवरोधकों की पहुंच के कारण कम से आंशिक रूप से बरकरार रहती है। इस तरह के जटिल प्रोटीज व्यवहार के न्यूट्रोफिल-मध्यस्थता सूजन शुरुआत और प्रचार पर महत्वपूर्ण परिणाम होते हैं, और इसलिए सटीक और जानकारीपूर्ण उपकरणों के साथ जांच किए जाने की आवश्यकता होती है।
इन वर्षों में, Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) आधारित जांच उपकरण है कि कुशलता से और तेजी से मानव नमूनों में एक विशिष्ट प्रोटीज गतिविधि का आकलन के रूप में कई जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों पाया13। कार्य करने के लिए, प्रोटीज़ रिपोर्टर्स एक मान्यता आकृति (यानी, एक पेप्टाइड) से बना होते हैं, जो लक्ष्य एंजाइम द्वारा मान्यता प्राप्त है और एक भौतिक प्रक्रिया पर भरोसा करता है, जहां उत्तेजन पर, एक दाता फ्लोरोफोर एक स्वीकार्य अणु को ऊर्जा स्थानांतरित करता है। रिपोर्टर पर एंजाइम द्वारा संचालित प्रसंस्करण, अर्थात् मान्यता भाग का दरार, स्वीकारकर्ता में परिणाम दाता से दूर फैलाना: एंजाइम गतिविधि इसलिए स्वीकारकर्ता फ्लोरेसेंस पर दाता में एक समय पर निर्भर परिवर्तन के रूप में मापा जाता है । इस तरह के पढ़े-जाने से आत्म-सामान्य और अनुपातमेट्रिक होता है, इसलिए पीएच और स्थानीय जांच एकाग्रता जैसी पर्यावरणीय स्थितियों से केवल मामूली रूप से प्रभावित होता है । NEmo-114 और SSAM15 FRET जांच है कि क्रमशः पूर्वोत्तर और तटरक्षक गतिविधि पर विशेष रूप से रिपोर्ट कर रहे हैं । हालांकि, ऐसे रिपोर्टर विशेष रूप से किसी भी सेलुलर डिब्बे में स्थानीयकरण नहीं करते हैं, इसलिए उन्हें मानव तरल पदार्थ में मौजूद प्रोटीज गतिविधि की निगरानी के लिए नियोजित किया जाता है। स्थानिक रूप से स्थानीय फैशन में प्रोटीज गतिविधि की निगरानी करने के लिए, हमने और अन्य लोगों ने एसवाईआरटी जांच विकसित की जो आणविक टैग 14 ,15, 16 ,17,18,19के माध्यम से उपकोशिकीय घटकों से संबद्ध है। इस तरह की सिंथेटिक रणनीति ने एनएमओ-2 और एमएसएएम के विकास की अनुमति दी, दो FRET जांच लिपिड एंकर से लैस हैं जो प्लाज्मा झिल्ली का स्थानीयकरण करते हैं। इन रिपोर्टर्स ने सिस्टिक फाइब्रोसिस और क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज14,15में एनई और सीजी प्रोटेसे की गहरी समझ को शह दी .
यहां, एनईएमओ और एसएआरटी जांच की सैम श्रृंखला के माध्यम से मानव थूक में घुलनशील और झिल्ली से बंधे एनई और सीजी गतिविधियों के दृश्य और मात्राकरण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किए जाते हैं। एनएसएपी रोगविज्ञान के विविध पहलुओं को संबोधित करने और उपयोगकर्ता-विशिष्ट आवश्यकता के अनुसार नियोजित किए जा सकने वाले तरीकों की एक सरणी प्रदान करने के लिए, फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोस्कोपी, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से विश्लेषण दिखाया गया है।
रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल मानव थूक के नमूनों में न्यूट्रोफिल इलास्टेज और कैथेप्सिन जी की गतिविधि की मात्रा निर्धारित करने के लिए विभिन्न दृष्टिकोणों की व्याख्या करते हैं। एक सफल एंजाइम गतिविधि माप के लिए महत्वपूर्ण अंक मैं) सटीक समय और ऑपरेटिव प्रक्रिया के मानकीकरण और ii) विश्वसनीय नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग कर रहे हैं । यदि इन स्थितियों को पूरा किया जाता है, तो वर्णित तरीके थूक तक ही सीमित नहीं हैं, लेकिन रक्त में प्रोटीज गतिविधि के विश्लेषण के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है, ब्रोंकोएल्वोलार लावेज तरल पदार्थ और ऊतक अनुभाग या समरूपता।
तीन तकनीकों में से प्रत्येक की अपनी ताकत और सीमाएं हैं, जो अक्सर एक दूसरे के पूरक हैं। उदाहरण के लिए, प्रवाह साइटोमेट्री दुर्लभ सेल आबादी के तेजी से विश्लेषण के साथ-साथ सेल फेनोटाइपिंग के लिए अनुमति देता है लेकिन स्थानिक संकल्प जानकारी का अभाव है, जिसे माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। इसके बजाय, प्लेट रीडर माप एक उच्च थ्रूपुट फैशन में कई नमूनों या शर्तों के समानांतर मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं। चूंकि ताजा थूक कोशिकाओं को जमे हुए और संग्रहीत नहीं किया जा सकता है, इसलिए तीन तरीकों की आवश्यकता होती है कि अनुमान के बाद नमूनों को तेजी से संसाधित किया जाना चाहिए। यह झिल्ली-बाध्य गतिविधि मापों के लचीलेपन या थ्रूपुट को सीमित करता है। एक प्रवाह साइटोमेट्री प्रोटोकॉल का विकास जो जांच के बाद कोशिकाओं को ठीक करने की अनुमति देता है और एंजाइमेटिक दरार अधिक संख्या में ट्यूबों के समानांतर माप के लिए खुलेगा। इसके अलावा, FRET जांच की हैंडलिंग और भंडारण पर विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए। दरअसल, पेप्टाइड सब्सट्रेट में मौजूद कुछ अमीनोएसिड्स जैसे मेथियोनिन ऑक्सीकरण से गुजरते हैं जिससे रिपोर्टर सेंसिटिविटी में कमी आती है । रिपोर्टर के शेल्फ लाइफ (20 डिग्री सेल्सियस पर लगभग तीन महीने का अनुमान) बढ़ाने के लिए, उन्हें नाइट्रोजन या आर्गन जैसी निष्क्रिय गैस के तहत छोटे वॉल्यूम एलिकोट्स (1-2μL) में संग्रहीत किया जा सकता है।
CF और अन्य पुरानी भड़काऊ फेफड़ों की बीमारियों में जितनी जल्दी हो सके सूजन का पता लगाना महत्वपूर्ण है, और विश्वसनीय बायोमार्कर में इस तरह के लक्ष्य को प्राप्त करने की क्षमता है। सतह से बंधे एनएसएप्स गतिविधि का पता लगाने की संभावना, जिसे आसपास के ऊतकों के लिए हानिकारक दिखाया गया है, उन परिस्थितियों में भी जब कोई या कम मुक्त एनई गतिविधि नहीं होती है, मूल्यवान जानकारी का एक और स्तर जोड़ता है, जिसे अन्य मौजूदा तरीकों के माध्यम से शायद ही हासिल किया जा सकता है4,11।
संवाददाताओं को विशेष रूप से अपनी शुरुआत में फेफड़ों की बीमारी की गंभीरता और प्रगति के साथ झिल्ली से बंधे एनएसपी गतिविधि के लिंक का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । तरीकों का उपयोग उपचार प्रभावकारिता (उदाहरण के लिए, विरोधी भड़काऊ उपचार या अत्यधिक प्रभावी सीएफटीआर मोडुलेटर और शक्तिशाली28)की निगरानी के लिए किया जा सकता है और न्यूट्रोफिल-चालित सूजन के परिणामस्वरूप गीला होने की जांच कर सकता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल गैर-आक्रामक नमूना प्रक्रियाओं पर आधारित हैं जो रोगी के लिए बहुत कम जोखिम लेते हैं और इसलिए, बहुत व्यापक पैमाने पर उपयोग किया जा सकता है और कई रोमांचक अनुप्रयोगों के लिए दरवाजे खोल सकते हैं।
The authors have nothing to disclose.
इस परियोजना को जर्मन शिक्षा और अनुसंधान मंत्रालय (FKZ 82DZL004A1 से एमए.M) और जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (एसएफबी-TR84TP B08 से एमए.M) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। इस पांडुलिपि में वर्णित काम को जर्मन सेंटर ऑफ लंग रिसर्च (डीजेएल) और एम.जी. के लिए पीएचडी फैलोशिप के माध्यम से ईएमबीएल हीडलबर्ग द्वारा समर्थित किया गया था। हम विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए जे Schatterny, एस Butz और एच Scheuermann शुक्रिया अदा करते हैं ।
100 µm Nylon cell strainer | Corning Inc. | 431752 | |
2300 EnSpire (Multilabel Plate Reader) | PerkinElmer | ||
35x10mm Dish, Nunclon Delta | Thermo Fisher Scientific | 150318 | |
40 µm Nylon cell strainer | Corning Inc. | 431750 | |
50 mL tubes | Sarstedt | 10535253 | |
7-AAD, viability dye | Bio Legend | 420404 | 5 µL/100 µL |
Balance | OHAUS Instruments (Shanghai) Co., Ltd. | PR124 | |
BD Falcon Round-Bottom Tubes 5 mL | BD Bioscience | 352054 | |
BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | ||
black flat bottom 96 well half area plate | Corning Life Science | 3694 | |
Cathepsin G | Elastin Products Company | SG623 | |
Cathepsin G Inhibitor I | Merck KGaA | 219372 | |
Centrifuge 5418R | Eppendorf AG | EP5401000137 | |
Combitips advanced 1.0 mL | Eppendorf AG | 0030 089 430 | |
cOmplete proteinase inhibitor | Roche | 11697498001 | |
Countig chambers improved Neubauer | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442 | |
coverslips Ø 25mm | Thermo Fisher Scientific | MENZCB00250RA003 | |
Cytospin 4 | Thermo Fisher Scientific | ||
DRAQ5 (nuclear stain) | BioStatus Limited | DR50050 | 1:10000 |
FACSDiva software, v8.0.1 | BD Bioscience | ||
FcBlock | BD Bioscience | 564219 | |
Fiji (Fiji Is Just ImageJ) | fiji.sc | ||
Flow Jo software, v10 | TreeStar | ||
FluoQ Plugin, v3-97 | |||
Heraeus Megafuge 16R | Thermo Fisher Scientific | ||
Human Sputum Leucocyte Elastase | Elastin Products Company | SE563 | |
Leica SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
Mini Rock-Shaker | PEQLAB Biotechnologie GmbH | MR-1 | |
mouse anti-human CD14, Pe-Cy7, clone M5E2 | BD Bioscience | 557742 Lot:8221983 | 1:50 |
mouse anti-human CD16, AF700, clone 3G8 | BD Bioscience | 557820 Lot:8208791 | 1:50 |
mouse anti-human CD45, APC-Cy7, clone 2D1 | BD Bioscience | 557833 Lot:8059688 | 1:33 |
mouse anti-human CD66b, PE/Dazzel 594, clone G10F5 | BioLegend | 305122 Lot:B241921 | 1:50 |
mSAM | in house | 2 mM | |
Multipette plus | Eppendorf AG | ||
NEmo-1 | SiChem | SC-0200 | 1 mM |
NEmo-2E | SiChem | SC-0201 | 2 mM |
Pari Boy SX with an LC Sprint jet nebulizer | Pari | 085G3001 | |
phosphate buffered saline | Gibco | 10010-015 | |
ROTI Histokitt (mounting medium) | Carl Roth GmbH + Co.KG | 6638.1 | |
Salbutamol | Teva GmbH | ||
Sivelestat | Cayman Chemicals | 17779 | |
Sputolysin | Calbiochem | 560000-1SET | |
sSAM | in house | 2 mM | |
SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | 10149870 | |
Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |