Protokollene heri beskrevet gir en guide for å visualisere og kvantifisere aktiviteten til nøytrofile proteaser i menneskelig sputum. Anvendelsen av slik analyse spenner fra evaluering av antiinflammatoriske behandlinger, til biomarkørvalidering, legemiddelscreening og store kliniske kohortstudier.
Proteaser er regulatorer av utallige fysiologiske prosesser, og den nøyaktige undersøkelsen av deres aktiviteter er fortsatt en spennende biomedisinsk utfordring. Blant de ~600 proteasene som er kodet av det menneskelige genom, undersøkes nøytrofile serinproteaser (NSP-er) grundig for deres involvering i utbruddet og progresjonen av inflammatoriske tilstander, inkludert luftveissykdommer. Unikt, utskilte NSP-er sprer seg ikke bare i ekstracellulære væsker, men også lokaliserer til plasmamembraner. Under nøytrofil ekstracellulær felle (NETs) dannelse, NSP blir en integrert del av utskilt kromatin. Slik kompleks atferd gjør forståelsen av NSP-patofysiologi til en utfordrende oppgave. Her er detaljerte protokoller vist å visualisere, kvantifisere og diskriminere frie og membranbundne nøytrofil elastase (NE) og cathepsin G (CG) aktiviteter i sputumprøver. NE og CG er NSP-er hvis aktiviteter har pleiotrope roller i patogenesen av cystisk fibrose (CF) og kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS): de fremmer vevsoppussing, regulerer nedstrøms immunresponser og korrelerer med lungesykdoms alvorlighetsgrad. Protokollene viser hvordan man skiller væske og cellulær brøkdel, samt isolering av nøytrofiler fra menneskelig sputum for enzymatisk aktivitets kvantifisering via småmolekyl Förster resonans energioverføringsbaserte (FRET) reportere. For å samle spesifikk innsikt i den relative rollen til NE- og CG-aktiviteter, kan en FRET-avlesning måles av forskjellige teknologier: i) in vitro platelesermålinger gir mulighet for høy gjennomstrømning og bulkdeteksjon av proteaseaktivitet; ii) konfektmikroskopi spatiotemporally løser membranbundet aktivitet på celleoverflaten; iii) småmolekyl fret strømning cytometri muliggjør rask evaluering av antiinflammatoriske behandlinger via encellet proteaseaktivitet kvantifisering og fenotyping. Implementeringen av slike metoder åpner dørene for å utforske NSP-patobiologi og deres potensial som biomarkører for sykdoms alvorlighetsgrad for CF og KOLS. Gitt deres standardiseringspotensial, deres robuste avlesning og enkel overføring, kan de beskrevne teknikkene umiddelbart deles for implementering på tvers av forsknings- og diagnostiske laboratorier.
Nøytrofil elastase (NE), cathepsin G (CG), proteinase 3 (PR3) og nøytrofil serinprotease 4 (NSP4) er de fire nøytrofile serinproteasene (NSP)1. De lagres, sammen med myeloperoxidase, innenfor nøytrofile primære eller azurofile granulater. På grunn av deres forhøyede proteolytiske innhold er sekresjonen av primære granulater tett regulert og nøytrofiler må utfordres sekvensielt med grunning og aktivering av stimuli2.
Inne i fagosomet fungerer NSP-er som intracellulære bakteriedrepende midler3. Når de utskilles, blir NSP-er sterke formidlere av betennelse: de cleave cytokiner og overflatereseptorer, aktiverer parallelle proinflammatoriske veier3. Det er viktig at inflammatoriske tilstander har en ukontrollert NSP-sekresjon. For eksempel, innenfor betente luftveier, forårsaker overdreven NE-aktivitet slim hypersekresjon, begerceller metaplasi, CFTR-inaktivering og ekstracellulær matriseoppussing4,5. Cathepsin G deltar også i betennelse: det klemmer spesielt og aktiverer to komponenter i IL-1-familien, IL-36α og IL-36β6. I samarbeid med NE cleaves CG proteaseaktiverte reseptorer på luftveisepitelet og aktiverer også TNF-α og IL-1β.
Endogene anti-proteaser som alfa-1-antitrypsin, alfa-1-antichymotrypsin og sekretorisk leukocytt proteasehemmer regulerer nøytrofil elastase og cathepsin G aktivitet5. Men i løpet av lungesykdomsprogresjonen overskrider den kontinuerlige sekresjonen av proteaser stoichiometrisk anti-proteaseskjoldet, noe som fører til ikke-løsende nøytrofililia i luftveiene, betennelse forverres og vevsskade5,7. Selv om NE-konsentrasjon og aktivitet i løselige fraksjoner av pasient luftveier har vist seg å være en lovende biomarkør for sykdomalvorlighetsgrad 8, NE og CG også knyttet til nøytrofil plasmamembran og til ekstracellulært DNA via elektrostatiske interaksjoner9,10 hvor de blir mindre tilgjengelige for anti-proteaser. Det er viktig at prekliniske studier definerte et scenario der celleoverflaterelatert proteaseaktivitet vises tidligere og/eller uavhengig av den løselige motparten4,11. Faktisk, for å bli påviselig, må fri proteaseaktivitet først overvelde anti-protease skjoldet. I stedet, på celleoverflaten, forblir membranbundet proteaseaktivitet i det minste delvis intakt på grunn av utilgjengeligheten av store hemmere til celleplasmamembranen12. Slik kompleks protease atferd har viktige konsekvenser på nøytrofilmediert betennelse utbrudd og forplantning, og må derfor undersøkes med presise og informative verktøy.
Gjennom årene fant Förster resonansenergioverføring (FRET)-baserte sonder mange biomedisinske applikasjoner som verktøy som effektivt og raskt vurderer en bestemt proteaseaktivitet i menneskelige prøver13. For å fungere består proteasereportere av et anerkjennelsesmotiv (dvs. et peptid), som er anerkjent av målenzymet og er avhengig av FRET, en fysisk prosess der en donorfluofor ved eksitasjon overfører energi til et akseptormolekyl. Behandlingen som drives av enzymet på reporteren, nemlig spaltingen av anerkjennelsesdelen, resulterer i at akseptoren sprer seg bort fra donoren: enzymaktiviteten måles derfor som en tidsavhengig endring i donoren over akseptorfluorescensen. Slik avlesning er selv-normaliserende og forholdsmessig, og påvirkes derfor bare marginalt av miljøforhold som pH og lokal sondekonsentrasjon. NEmo-114 og sSAM15 er FRET-sonder som rapporterer spesifikt om henholdsvis NE- og CG-aktivitet. Imidlertid lokaliserer slike reportere ikke spesielt til noe cellulært rom, derfor brukes de til å overvåke proteaseaktiviteten som er tilstede i menneskelige væsker. For å overvåke proteaseaktivitet på en romlig lokalisert måte utviklet vi og andre FRET-sonder som knytter seg til subcellulære komponenter via molekylære koder14,15,16,17,18,19. En slik syntetisk strategi tillot utvikling av NEmo-2 og mSAM, to FRET-sonder utstyrt med lipidankere som lokaliserer til plasmamembranen. Disse reporterne førte til en dypere forståelse av NE- og CG-proteaser i cystisk fibrose og kroniske obstruktive lungesykdommer14,15.
Her er det gitt detaljerte protokoller for visualisering og kvantifisering av løselige og membranbundne NE- og CG-aktiviteter i menneskelig sputum ved hjelp av NEmo- og SAM-serien av FRET-sonder. For å adressere ulike aspekter ved NSP-patofysiologi og gi en rekke metoder som kan brukes i henhold til det brukerspesifikke behovet, vises analysen via fluorescensspektroskopi, fluorescensmikroskopi og strømningscytometri.
De rapporterte protokollene forklarer ulike tilnærminger for å kvantifisere aktiviteten til nøytrofil elastase og cathepsin G i humane sputumprøver. Kritiske punkter for en vellykket måling av enzymaktivitet er i) presis timing og standardisering av den operative prosedyren og ii) bruk av pålitelige negative og positive kontroller. Hvis disse forholdene er oppfylt, er de beskrevne metodene ikke begrenset til sputum, men kan også lett tilpasses analysen av proteaseaktivitet i blod, bronkoalveolar lavagevæsker og vevsseksjoner eller homogenater.
Hver av de tre teknikkene har sine styrker og begrensninger, som ofte utfyller hverandre. For eksempel tillater strømningscytometri rask analyse av sjeldne cellepopulasjoner samt cellefenotyping, men mangler romlig oppløsningsinformasjon, som kan oppnås ved mikroskopi. I stedet tillater måling av platelesere parallell vurdering av flere prøver eller forhold på en høy gjennomstrømningsmote. Siden friske sputumceller ikke kan fryses og lagres, krever de tre metodene at prøver må behandles raskt etter ekspektorering. Dette begrenser fleksibiliteten eller gjennomstrømningen til de membranbundne aktivitetsmålingene. Utviklingen av en strømningscytometriprotokoll som gjør det mulig å fikse celler etter sondetilsetning og enzymatisk spalting, vil åpne for parallell måling av et høyere antall rør. Videre bør det tas særlig hensyn til håndtering og lagring av FRET-sondene. Faktisk gjennomgår noen aminoacider som er tilstede i peptidssubstratet, som metionin, oksidasjon som fører til redusert reporterfølsomhet. For å øke reporterens holdbarhet (anslått til omtrent tre måneder ved 20 °C), kan de lagres i små volum aliquots (1-2 μL) under inert gass som Nitrogen eller Argon.
I CF og andre kroniske inflammatoriske lungesykdommer er det viktig å oppdage betennelsen så tidlig som mulig, og pålitelige biomarkører har potensial til å oppnå et slikt mål. Muligheten til å oppdage overflatebundet NSP-aktivitet, som har vist seg å være skadelig for det omkringliggende vevet, også under forhold der det ikke er noen eller liten fri NE-aktivitet, legger til et annet nivå av verdifull informasjon, som knapt kan oppnås ved hjelp av andre eksisterende metoder4,11.
Reporterne kan brukes til å studere koblingen av membranbundet assosiert NSP-aktivitet med alvorlighetsgrad og progresjon av lungesykdom, spesielt ved tidlig start. Metodene kan brukes til å overvåke behandlingseffekten (f.eks. antiinflammatoriske behandlinger eller svært effektive CFTR-modulatorer og potensiatorer28) og undersøke den resulterende dempingen av nøytrofildrevet betennelse. I tillegg er protokollene basert på ikke-invasive prøveprosedyrer som har svært lav risiko for pasienten og derfor kan brukes i svært bred skala og åpne dørene for mange spennende applikasjoner.
The authors have nothing to disclose.
Dette prosjektet ble støttet av tilskudd fra det tyske kunnskapsdepartementet (FKZ 82DZL004A1 til M.A.M) og Den tyske forskningsstiftelsen (SFB-TR84TP B08 til M.A.M). Arbeidet beskrevet i dette manuskriptet ble støttet av Det tyske senter for lungeforskning (DZL) og EMBL Heidelberg gjennom et stipendiatstipend for M.G. Vi takker J. Schatterny, S. Butz og H. Scheuermann for ekspert teknisk assistanse.
100 µm Nylon cell strainer | Corning Inc. | 431752 | |
2300 EnSpire (Multilabel Plate Reader) | PerkinElmer | ||
35x10mm Dish, Nunclon Delta | Thermo Fisher Scientific | 150318 | |
40 µm Nylon cell strainer | Corning Inc. | 431750 | |
50 mL tubes | Sarstedt | 10535253 | |
7-AAD, viability dye | Bio Legend | 420404 | 5 µL/100 µL |
Balance | OHAUS Instruments (Shanghai) Co., Ltd. | PR124 | |
BD Falcon Round-Bottom Tubes 5 mL | BD Bioscience | 352054 | |
BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | ||
black flat bottom 96 well half area plate | Corning Life Science | 3694 | |
Cathepsin G | Elastin Products Company | SG623 | |
Cathepsin G Inhibitor I | Merck KGaA | 219372 | |
Centrifuge 5418R | Eppendorf AG | EP5401000137 | |
Combitips advanced 1.0 mL | Eppendorf AG | 0030 089 430 | |
cOmplete proteinase inhibitor | Roche | 11697498001 | |
Countig chambers improved Neubauer | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442 | |
coverslips Ø 25mm | Thermo Fisher Scientific | MENZCB00250RA003 | |
Cytospin 4 | Thermo Fisher Scientific | ||
DRAQ5 (nuclear stain) | BioStatus Limited | DR50050 | 1:10000 |
FACSDiva software, v8.0.1 | BD Bioscience | ||
FcBlock | BD Bioscience | 564219 | |
Fiji (Fiji Is Just ImageJ) | fiji.sc | ||
Flow Jo software, v10 | TreeStar | ||
FluoQ Plugin, v3-97 | |||
Heraeus Megafuge 16R | Thermo Fisher Scientific | ||
Human Sputum Leucocyte Elastase | Elastin Products Company | SE563 | |
Leica SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
Mini Rock-Shaker | PEQLAB Biotechnologie GmbH | MR-1 | |
mouse anti-human CD14, Pe-Cy7, clone M5E2 | BD Bioscience | 557742 Lot:8221983 | 1:50 |
mouse anti-human CD16, AF700, clone 3G8 | BD Bioscience | 557820 Lot:8208791 | 1:50 |
mouse anti-human CD45, APC-Cy7, clone 2D1 | BD Bioscience | 557833 Lot:8059688 | 1:33 |
mouse anti-human CD66b, PE/Dazzel 594, clone G10F5 | BioLegend | 305122 Lot:B241921 | 1:50 |
mSAM | in house | 2 mM | |
Multipette plus | Eppendorf AG | ||
NEmo-1 | SiChem | SC-0200 | 1 mM |
NEmo-2E | SiChem | SC-0201 | 2 mM |
Pari Boy SX with an LC Sprint jet nebulizer | Pari | 085G3001 | |
phosphate buffered saline | Gibco | 10010-015 | |
ROTI Histokitt (mounting medium) | Carl Roth GmbH + Co.KG | 6638.1 | |
Salbutamol | Teva GmbH | ||
Sivelestat | Cayman Chemicals | 17779 | |
Sputolysin | Calbiochem | 560000-1SET | |
sSAM | in house | 2 mM | |
SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | 10149870 | |
Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |