Protokollen häri beskrivs ge en guide för att visualisera och kvantifiera aktiviteten av neutrophil proteaser i mänskliga sputum. Tillämpningarna av sådan analys sträcker sig från utvärdering av antiinflammatoriska behandlingar, till biomarkörvalidering, läkemedelsscreening och stora kohort kliniska studier.
Proteaser är regulatorer av otaliga fysiologiska processer och den exakta undersökningen av deras verksamhet är fortfarande en spännande biomedicinsk utmaning. Bland de ~ 600 proteaser kodade av det mänskliga genomet undersöks neutrofila serinproteaser (NSPs) noggrant för deras inblandning i uppkomsten och progressionen av inflammatoriska tillstånd inklusive andningssjukdomar. Unikt, utsöndrade NSPs inte bara diffusa inom extracellulära vätskor utan också lokalisera till plasmamembran. Under neutrophil extracellulär fälla (NETs) bildandet, NSPs blir en integrerad del av den utsöndrade kromatin. Ett sådant komplext beteende gör förståelsen av NSPs patofysiologi till en utmanande uppgift. Här visas detaljerade protokoll visualisera, kvantifiera och diskriminera fria och membranbundna neutrofilalastas (NE) och cathepsin G (CG) aktiviteter i sputumprover. NE och CG är NSPs vars verksamhet har pleiotropa roller i patogenesen vid cystisk fibros (CF) och kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL): de främjar vävnadsrenovering, reglerar immunsvar nedströms och korrelerar med lungsjukdomens svårighetsgrad. Protokollen visar hur man separerar vätska och cellulär fraktion, liksom isolering av neutrofiler från mänskligt sputum för enzymatisk aktivitetsk kvantifiering via småmolekylen Förster resonans energiöverföringsbaserade (FRET) reportrar. För att samla in specifika insikter om ne- och CG-aktiviteters relativa roll kan en FRET-avläsning mätas med olika tekniker: i) mätningar av in vitro-plåtläsare möjliggör hög genomströmning och massdetektering av proteasaktivitet; ii) konfokal mikroskopi spatiotemporally löser membranbunden aktivitet vid cellytan; iii) småmolekyler FRET flöde cytometri möjliggör snabb utvärdering av antiinflammatoriska behandlingar via encellig proteas aktivitet kvantifiering och fenotypning. Genomförandet av sådana metoder öppnar dörrarna för att utforska NSPs patobiologi och deras potential som biomarkörer för sjukdomens svårighetsgrad för CF och KOL. Med tanke på deras standardiseringspotential, deras robusta avläsning och enkelhet i överföringen är de beskrivna teknikerna omedelbart delbara för implementering över forsknings- och diagnostiska laboratorier.
Neutrofilalastas (NE), cathepsin G (CG), proteinas 3 (PR3) och neutrofilserinproteas 4 (NSP4) är de fyra neutrofila serinproteaserna (NSPs)1. De lagras, tillsammans med myeloperoxidas, inom neutrofil primära eller azurofila granuler. På grund av deras förhöjda proteolytiska innehåll är utsöndring av primära granulat tätt reglerad och neutrofiler måste i tur och nedförvisas med priming och aktiverande stimuli2.
Inuti faagolysosomen fungerar NSPs som intracellulära bakteriedödande medel3. När de utsöndras blir NSPs starka medlare av inflammation: de klyver cytokiner och ytreceptorer och aktiverar parallella proinflammatoriska vägar3. Viktigt är att inflammatoriska tillstånd har en okontrollerad NSPs utsöndring. Till exempel, inom inflammerade luftvägar, orsakar överdriven NE-aktivitet slem hypersecretion, bägare celler metaplasi, CFTR inaktivering och extracellulär matris ombyggnad4,5. Cathepsin G deltar också i inflammation: det klyver specifikt och aktiverar två komponenter i IL-1-familjen, IL-36α och IL-36β6. I samarbete med NE klyver CG proteasaktiverade receptorer på luftvägsepiteleriet och aktiverar även TNF-α och IL-1β.
Endogena antiproteaser såsom alfa-1-antitrypsin, alfa-1-antichymotrypsin och den sekretoriska leukocyt proteashämmaren reglerar neutrofila elastas och cathepsin G aktivitet5. Men under lungsjukdomens progression överstiger den kontinuerliga utsöndring av proteaser stoichiometriskt antiproteasskölden, vilket leder till icke-lösning av neutrofili i luftvägarna, inflammationsförsämring ochvävnadsskada 5,7. Även om NE koncentration och aktivitet i lösliga fraktioner av patientens luftvägar har visat sig vara en lovande biomarkör av sjukdomens svårighetsgrad8,ne och CG associeras också till neutrofil plasmamembranet och extracellulärt DNA via elektrostatiska interaktioner9,10 där de blir mindre tillgängliga för antiproteaser. Viktigt är att prekliniska studier definierade ett scenario där cellytans associerade proteasaktivitet uppträder tidigare och/eller oberoende av dess lösliga motsvarighet4,11. Faktum är att för att bli detekterbar måste gratis proteasaktivitet först överväldiga antiproteasskölden. Vid cellytan förblir istället membranbunden proteasaktivitet åtminstone delvis intakt på grund av att stora hämmare är otillgängliga för cellplasmamembranet12. Sådant komplext proteasbeteende har viktiga konsekvenser för neutrofilmedierad inflammationsuppkomst och förökning, och behöver därför undersökas med exakta och informativa verktyg.
Under årens lopp har Förster resonansenergiöverföring (FRET)-baserade sonder hittat många biomedicinska tillämpningar som verktyg som effektivt och snabbt bedömer en specifik proteasaktivitet i mänskliga prover13. För att fungera består proteasereportrar av ett igenkänningsmotiv (dvs. en peptid), som känns igen av målenzymet och förlitar sig på FRET, en fysisk process där en donatorfluorofor vid excitation överför energi till en acceptormolekyl. Den bearbetning som drivs av enzymet på reportern, nämligen klyvningen av erkännandedelen, resulterar i att acceptorn sprids bort från givaren: enzymaktiviteten mäts därför som en tidsberoende förändring i givaren över acceptorfluorescensen. Sådan avläsning är självnormaliserande och ratiometrisk, vilket endast marginellt påverkas av miljöförhållanden som pH och lokal sondkoncentration. NEmo-114 och sSAM15 är FRET-sonder som rapporterar specifikt om NE- respektive CG-aktivitet. Sådana reportrar lokaliserar dock inte specifikt till något cellområde, därför används de för att övervaka proteasaktiviteten som finns i mänskliga vätskor. För att övervaka proteasaktivitet på ett rumsligt lokaliserat sätt utvecklade vi och andra FRET-sonder som associerar till subcellulära komponenter viamolekylära taggar 14,15,16,17,18,19. En sådan syntetisk strategi tillät utvecklingen av NEmo-2 och mSAM, två FRET-sonder utrustade med lipidankare som lokaliserar till plasmamembranet. Dessa reportrar underblåste en djupare förståelse av NE och CG proteaser i cystisk fibros och kronisk obstruktiv lungsjukdom14,15.
Här tillhandahålls detaljerade protokoll för visualisering och kvantifiering av lösliga och membranbundna NE- och CG-aktiviteter i mänskligt sputum med hjälp av NEmo- och SAM-serien av FRET-sonder. För att ta itu med olika aspekter av NSPs patofysiologi och tillhandahålla en rad metoder som kan användas enligt det användarspecifika behovet visas analysen via fluorescensspektroskopi, fluorescensmikroskopi och flödescytometri.
De rapporterade protokollen förklarar olika metoder för att kvantifiera aktiviteten hos neutrophil elastase och cathepsin G i mänskliga sputum prover. Kritiska punkter för en framgångsrik enzymaktivitetsmätning är i) exakt timing och standardisering av det operativa förfarandet och ii) användningen av tillförlitliga negativa och positiva kontroller. Om dessa villkor är uppfyllda är de beskrivna metoderna inte begränsade till sputum utan kan också enkelt anpassas till analysen av proteasaktivitet i blod, bronkolveolära lavagevätskor och vävnadssektioner eller homogenat.
Var och en av de tre teknikerna har sina styrkor och begränsningar, som ofta kompletterar varandra. Till exempel möjliggör flödescytometri snabb analys av sällsynta cellpopulationer samt cell fenotypning men saknar rumslig upplösningsinformation, vilket kan uppnås genom mikroskopi. I stället möjliggör plåtläsarmätningar en parallell bedömning av flera prover eller förhållanden på ett höggenomströmnings sätt. Eftersom färska sputumceller inte kan frysas och lagras kräver de tre metoderna att proverna måste bearbetas snabbt efter expectoration. Detta begränsar flexibiliteten eller genomströmningen av de membranbundna aktivitetsmätningarna. Utvecklingen av ett flöde cytometri protokoll som gör det möjligt att fixa celler efter sond tillägg och enzymatisk klyvning skulle öppna för parallell mätning av ett högre antal rör. Dessutom bör särskild uppmärksamhet ägnas åt hantering och lagring av FRET-sonderna. Faktum är att vissa aminosyror som finns i peptidsubstratet, såsom metionin, genomgår oxidation vilket leder till minskad reporterkänslighet. För att öka reporterns hållbarhet (uppskattad till cirka tre månader vid 20 °C) kan de lagras i små volymer alikvoter (1-2 μL) under inert gas som kväve eller argon.
I CF och andra kroniska inflammatoriska lungsjukdomar är det viktigt att upptäcka inflammationen så tidigt som möjligt, och pålitliga biomarkörer har potential att uppnå ett sådant mål. Möjligheten att upptäcka ytbunden NSP-aktivitet, som har visat sig vara skadlig för den omgivande vävnaden, även under förhållanden när det inte finns någon eller liten fri NE-aktivitet, lägger till en annan nivå av värdefull information, som knappast kan uppnås med hjälp av andra befintliga metoder4,11.
Reportrarna kan användas för att studera sambandet mellan membranbunden associerad NSP-aktivitet med svårighetsgrad och progression av lungsjukdom, särskilt vid dess tidiga början. Metoderna kan användas för att övervaka behandlingseffekten (t.ex. antiinflammatoriska behandlingar eller mycket effektiva CFTR-modulatorer och potentiatorer28) och undersöka den resulterande dämpningen av neutrofildriven inflammation. Dessutom är protokollen baserade på icke-invasiva provförfaranden som medför mycket låg risk för patienten och därför kan användas i mycket stor skala och öppna dörrarna för många spännande applikationer.
The authors have nothing to disclose.
Detta projekt stöddes av bidrag från det tyska ministeriet för utbildning och forskning (FKZ 82DZL004A1 till M.A.M) och den tyska forskningsstiftelsen (SFB-TR84TP B08 till M.A.M). Arbete som beskrivs i detta manuskript stöddes av german Center of Lung Research (DZL) och EMBL Heidelberg genom ett doktorandstipendium för M.G. Vi tackar J. Schatterny, S. Butz och H. Scheuermann för teknisk hjälp.
100 µm Nylon cell strainer | Corning Inc. | 431752 | |
2300 EnSpire (Multilabel Plate Reader) | PerkinElmer | ||
35x10mm Dish, Nunclon Delta | Thermo Fisher Scientific | 150318 | |
40 µm Nylon cell strainer | Corning Inc. | 431750 | |
50 mL tubes | Sarstedt | 10535253 | |
7-AAD, viability dye | Bio Legend | 420404 | 5 µL/100 µL |
Balance | OHAUS Instruments (Shanghai) Co., Ltd. | PR124 | |
BD Falcon Round-Bottom Tubes 5 mL | BD Bioscience | 352054 | |
BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | ||
black flat bottom 96 well half area plate | Corning Life Science | 3694 | |
Cathepsin G | Elastin Products Company | SG623 | |
Cathepsin G Inhibitor I | Merck KGaA | 219372 | |
Centrifuge 5418R | Eppendorf AG | EP5401000137 | |
Combitips advanced 1.0 mL | Eppendorf AG | 0030 089 430 | |
cOmplete proteinase inhibitor | Roche | 11697498001 | |
Countig chambers improved Neubauer | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442 | |
coverslips Ø 25mm | Thermo Fisher Scientific | MENZCB00250RA003 | |
Cytospin 4 | Thermo Fisher Scientific | ||
DRAQ5 (nuclear stain) | BioStatus Limited | DR50050 | 1:10000 |
FACSDiva software, v8.0.1 | BD Bioscience | ||
FcBlock | BD Bioscience | 564219 | |
Fiji (Fiji Is Just ImageJ) | fiji.sc | ||
Flow Jo software, v10 | TreeStar | ||
FluoQ Plugin, v3-97 | |||
Heraeus Megafuge 16R | Thermo Fisher Scientific | ||
Human Sputum Leucocyte Elastase | Elastin Products Company | SE563 | |
Leica SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
Mini Rock-Shaker | PEQLAB Biotechnologie GmbH | MR-1 | |
mouse anti-human CD14, Pe-Cy7, clone M5E2 | BD Bioscience | 557742 Lot:8221983 | 1:50 |
mouse anti-human CD16, AF700, clone 3G8 | BD Bioscience | 557820 Lot:8208791 | 1:50 |
mouse anti-human CD45, APC-Cy7, clone 2D1 | BD Bioscience | 557833 Lot:8059688 | 1:33 |
mouse anti-human CD66b, PE/Dazzel 594, clone G10F5 | BioLegend | 305122 Lot:B241921 | 1:50 |
mSAM | in house | 2 mM | |
Multipette plus | Eppendorf AG | ||
NEmo-1 | SiChem | SC-0200 | 1 mM |
NEmo-2E | SiChem | SC-0201 | 2 mM |
Pari Boy SX with an LC Sprint jet nebulizer | Pari | 085G3001 | |
phosphate buffered saline | Gibco | 10010-015 | |
ROTI Histokitt (mounting medium) | Carl Roth GmbH + Co.KG | 6638.1 | |
Salbutamol | Teva GmbH | ||
Sivelestat | Cayman Chemicals | 17779 | |
Sputolysin | Calbiochem | 560000-1SET | |
sSAM | in house | 2 mM | |
SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | 10149870 | |
Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |