दाद सिंप्लेक्स वायरस-1 एंटीवायरल की प्रभावकारिता का अध्ययन करने के लिए पोर्सिन कॉर्नियल ऊतक एक्सप्लांट
Summary
हम प्रायोगिक दवाओं की एंटीवायरल प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए एक पोर्सिन कॉर्निया के उपयोग का वर्णन करते हैं।
Abstract
वायरस और बैक्टीरिया कॉर्नियल संक्रमण के माध्यम से कई प्रकार के नेत्र सतह दोष और पतन जैसे घावों और अल्सर का कारण बन सकते हैं। दुनिया भर में 60-90% से लेकर एक सेरोप्रेवलेंस के साथ, हर्पीस सिंप्लेक्स वायरस टाइप-1 (एचएसवी-1) आमतौर पर ओरोफेशियल क्षेत्र के म्यूकोक्यूटेनियस घावों का कारण बनता है जो घावों और संक्रमण से जुड़े अंधापन के रूप में भी प्रकट होता है। जबकि वर्तमान एंटीवायरल दवाएं प्रभावी हैं, प्रतिरोध और विषाक्त दुष्प्रभावों के हठ के उद्भव से इस सर्वव्यापी रोगजनक के खिलाफ उपन्यास एंटीवायरल के विकास की आवश्यकता होती है। हालांकि इन विट्रो मूल्यांकन एक उभरते एंटीवायरल के बारे में कुछ कार्यात्मक डेटा प्रदान करता है, वे वीवो में नेत्र ऊतक की जटिलता का प्रदर्शन नहीं करते हैं। हालांकि, वीवो अध्ययन में महंगे होते हैं और प्रशिक्षित कर्मियों की आवश्यकता होती है, खासकर वायरल एजेंटों के साथ काम करते समय। इसलिए पूर्व वीवो मॉडल एंटीवायरल परीक्षण के लिए कुशल अभी तक सस्ती कदम हैं। यहां हम पोर्सिन कॉर्निया पूर्व वीवो का उपयोग करके एचएसवी-1 द्वारा संक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल पर चर्चा करते हैं और मौजूदा और उपन्यास एंटीवायरल दवाओं का उपयोग करके उन्हें सामयिक रूप से इलाज करने की विधि है। हम एचएसवी-1 का उपयोग करके पट्टिका परख करने की विधि भी प्रदर्शित करते हैं। विस्तृत तरीकों का उपयोग एचएसवी-1 रोगजनक के समान संक्रमणों का अध्ययन करने के लिए समान प्रयोगों का संचालन करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
नेत्र संक्रमण से पीड़ित लोगों को अक्सर दृष्टि हानि उठानी पड़ती है1. दुनिया भर में एक उच्च सेरोप्रेवलेंस के साथ, एचएसवी संक्रमित व्यक्ति आवर्ती आंखों के संक्रमण से पीड़ित होते हैं जो कॉर्नियल स्कारिंग, स्ट्रोमल केराटिटिस और नियोवैस्कुलराइजेशन2,3,4, 5का कारणबनतेहैं। एचएसवी संक्रमण भी कम बार कारण दिखाया गया है, इम्यूनोसमझौता के बीच गंभीर स्थितियों की एक श्रृंखला, इंसेफेलाइटिस और प्रणालीगत रुग्णता6,7,8जैसे अनुपचारित रोगियों । एसीक्लिवोविर (एसीवी) और इसके न्यूक्लियोसाइड एनालॉग जैसी दवाओं ने एचएसवी-1 संक्रमण को रोकने और यहां तक कि पुनर्सक्रियण को नियंत्रित करने में लगातार सफलता दिखाई है फिर भी इन दवाओं का लंबे समय तक उपयोग गुर्दे की विफलता, भ्रूण असामान्यताओं और विकसित वायरल उपभेदों के लिए दवा प्रतिरोध के उद्भव को प्रतिबंधित करने में विफलता के साथ जुड़ा हुआ है9,10,11, 12,13। एचएसवी-1 नेत्र संक्रमण से जुड़ी जटिलताओं का पहले मोनोलेयर और मानव कॉर्नियल कोशिकाओं की 3 डी संस्कृतियों और वीवो में मुरीन या खरगोश नेत्र संक्रमणों का उपयोग करके विट्रो में अध्ययन किया गया है। हालांकि ये इन इन विट्रो मॉडल एचएसवी-1 संक्रमणों के सेलुलर जैविक घटकों पर महत्वपूर्ण डेटा प्रदान करते हैं, हालांकि, वे कॉर्नियल ऊतक की जटिल जटिलता की नकल करने में विफल रहते हैं और वायरस14के डेंड्रिटिक प्रसार को रोशन करने के लिए कुछ नहीं करते हैं। इसके विपरीत, हालांकि वीवो सिस्टम में एचएसवी-1 संक्रमण के दौरान कॉर्निया और प्रतिरक्षा सक्रियण प्रतिक्रियाओं में फैले संक्रमण को दिखाने में अधिक व्यावहारिक होते हैं, वे चेतावनी के साथ आते हैं कि उन्हें प्रयोगों को नजरअंदाज करने के लिए प्रशिक्षित जांचकर्ताओं और पशु देखभाल के लिए बड़ी सुविधाओं की आवश्यकता होती है।
यहां हम एचएसवी-1 संक्रमण प्रेरित घाव प्रणाली की जांच करने के लिए एक पूर्व वीवो मॉडल के रूप में पोर्सिन कॉर्निया का उपयोग करते हैं। संक्रमण के कारण घाव प्रणाली के सेल और आणविक जीव विज्ञान के संभावित औषध विज्ञान दोनों का अध्ययन ऊतक एक्सप्लांट संस्कृतियों के माध्यम से किया जा सकता है। इस मॉडल को अन्य वायरल और बैक्टीरियल संक्रमणों के लिए भी उपयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है। इस अध्ययन में, पोर्सिन कॉर्निया का उपयोग एक प्रीक्लीनिकल छोटे अणु, BX795 की एंटीवायरल प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए किया गया था। पहुंच में आसानी और लागत प्रभावशीलता के कारण पोर्सिन कॉर्निया के उपयोग को प्राथमिकता दी गई थी। इसके अतिरिक्त, पोर्सिन कॉर्नियल मॉडल मानव आंखों के अच्छे मॉडल हैं, कॉर्निया को अलग करना आसान है, संक्रमण और दृश्य के लिए पर्याप्त आकार और15को संभालने के लिए मजबूत। पोर्सिन कॉर्निया ट्रांस कॉर्नियल पारमेबिलिटी और प्रणालीगत अवशोषणदोनोंमें मानव कॉर्नियल मॉडल की जटिलता के बराबर भी हैं। अध्ययन के लिए इस मॉडल का उपयोग करके, हम यह स्पष्ट करने में सक्षम थे कि BX795 एचएसवी-1 वायरस संक्रमण के एक सक्षम अवरोधक के रूप में आगे की जांच के योग्य कैसे है और इसे एक संभावित छोटे अणु एंटीवायरल यौगिक16के रूप में वर्गीकृत करने के साहित्य में जोड़ता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
पूर्व अनुसंधान एचएसवी-1 संक्रमण के खिलाफ एक एंटीवायरल एजेंट के रूप में एक आशाजनक भूमिका के लिए BX795 दिखाया गया है; टैंक-बाइंडिंग किनेज़ 1 (TBK1)16को रोककर । टीबीके 1 और ऑटोफैगी दोनों ने एचएसवी-1 संक्रमण ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन NIH अनुदान (R01 EY024710, RO1 AI139768, और RO1 EY029426) द्वारा डीएस एए को राष्ट्रीय नेत्र संस्थान, NIH से एक F30EY025981 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । पार्क पैकिंग कंपनी, 4107 एशलैंड एवेन्यू, न्यू सिटी, शिकागो, आईएल-60609 से प्राप्त पोर्सिन कॉर्निया का उपयोग करके अध्ययन किया गया था
Materials
| 30 G hypodermic needles. | BD | 305128 | |
| 500 mL glass bottle. | Thomas Scientific | 844027 | |
| Antimycotic and Antibiotic (AA) | GIBCO | 15240096 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Benchtop vortexer. | BioDot | BDVM-3200 | |
| Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification. | Thermofisher Scientific | Herasafe 2030i | |
| Calgiswab 6" Sterile Calcium Alginate Standard Swabs. | Puritan | 22029501 | |
| Cell scraper – 25 cm | Biologix BE | 70-1180 70-1250 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | C6158 | Store the powder in a dark place |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium – DMEM | GIBCO | 41966029 | Store at 4 °C until use |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fetal bovine serum -FBS | Sigma Aldrich | F2442 | Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use |
| Flat edged tweezers – 2. | Harward Instruments | 72-8595 | |
| Freezers –80 °C. – | Thermofisher Scientific | 13 100 790 | |
| Fresh box of blades. | Thomas Scientific | TE05091 | |
| Guaze | Johnson & Johnson | 108 square inch folder 12 ply | |
| HSV-1 17GFP | grown in house | – | Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17 |
| Insulin, Transferrin, Selenium – ITS | GIBCO | 41400045 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Magnetic stirrer. | Thomas Scientific | H3710-HS | |
| Metallic Scissors. | Harward Instruments | 72-8400 | |
| Micropipettes 1 to 1000 µL. | Thomas Scientific | 1159M37 | |
| Minimum Essential Medium – MEM | GIBCO | 11095080 | Store at 4 °C until use |
| OptiMEM | GIBCO | 31985047 | Store at 4 °C until use |
| Penicillin/streptomycin. | GIBCO | 15140148 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Phosphate Buffer Saline -PBS | GIBCO | 10010072 | Store at room temperature |
| Porcine Corneas | Park Packaging Co., Chicago, IL | 0 | Special order by request |
| Procedure bench covers – as needed. | Thermofisher Scientific | S42400 | |
| Serological Pipettes | Thomas Scientific | P7132, P7127, P7128, P7129, P7137 | |
| Serological Pipetting equipment. | Thomas Scientific | Ezpette Pro | |
| Stereoscope | Carl Zeiss | SteREO Discovery V20 | |
| Stirring magnet. | Thomas Scientific | F37120 | |
| Tissue culture flasks, T175 cm2. | Thomas Scientific | T1275 | |
| Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 °C temperature. | Thermofisher Scientific | Forma 50145523 | |
| Tissue culture treated plates (6-well). | Thomas Scientific | T1006 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25-300-062 | Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use |
| Vero cells | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1586 |
Referências
- Liesegang, T. J. Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance. Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).
- Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells. Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).
- Farooq, A. V., Shah, A., Shukla, D. The role of herpesviruses in ocular infections. Virus Adaptation and Treatment. 2 (1), 115-123 (2010).
- Xu, F., et al. Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994. Journal of Infectious Diseases. 185 (8), 1019-1024 (2002).
- Xu, F., et al. Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States. Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).
- Koganti, R., Yadavalli, T., Shukla, D. Current and emerging therapies for ocular herpes simplex virus type-1 infections. Microorganisms. 7 (10), (2019).
- Lobo, A. -., Agelidis, A. M., Shukla, D. Pathogenesis of herpes simplex keratitis: The host cell response and ocular surface sequelae to infection and inflammation. Ocular Surface. 17 (1), 40-49 (2019).
- Koujah, L., Suryawanshi, R. K., Shukla, D. Pathological processes activated by herpes simplex virus-1 (HSV-1) infection in the cornea. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (3), 405-419 (2019).
- Lass, J. H., et al. Antiviral medications and corneal wound healing. Antiviral Research. 4 (3), 143-157 (1984).
- Burns, W. H., et al. Isolation and characterisation of resistant Herpes simplex virus after acyclovir therapy. Lancet. 1 (8269), 421-423 (1982).
- Crumpacker, C. S., et al. Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir. New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).
- Yildiz, C., et al. Acute kidney injury due to acyclovir. CEN Case Report. 2 (1), 38-40 (2013).
- Fleischer, R., Johnson, M. Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy. Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).
- Thakkar, N., et al. Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells. Science Report. 7, 42559 (2017).
- Pescina, S., et al. et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).
- Jaishankar, D., et al. An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye. Science Translational Medicine. 10, 5861 (2018).
- Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).
