Caractérisation fonctionnelle des variantes de RYR1 humaines exprimées de manière endogène
Summary
Ici, les méthodes utilisées pour étudier l’effet fonctionnel des mutations RYR1 exprimées de manière endogène dans les lymphocytes B humains immortalisés par le virus d’Epstein Barr et les cellules satellites dérivées de la biopsie musculaire différenciées en myotubes sont décrites.
Abstract
Plus de 700 variantes du gène RYR1 ont été identifiées chez des patients atteints de différents troubles neuromusculaires, notamment une susceptibilité à l’hyperthermie maligne, des myopathies centrales et une myopathie centronucléaire. En raison des divers phénotypes liés aux mutations RYR1, il est fondamental de caractériser leurs effets fonctionnels pour classer les variantes portées par les patients pour de futures interventions thérapeutiques et identifier les variantes non pathogènes. De nombreux laboratoires se sont intéressés au développement de méthodes pour caractériser fonctionnellement les mutations RYR1 exprimées dans les cellules des patients. Cette approche présente de nombreux avantages, notamment: les mutations sont exprimées de manière endogène, RyR1 n’est pas surexprimé, l’utilisation de cellules hétérologues exprimant RyR1 est évitée. Cependant, étant donné que les patients peuvent présenter des mutations dans différents gènes en dehors de RYR1, il est important de comparer les résultats du matériel biologique d’individus hébergeant la même mutation, avec des antécédents génétiques différents. Le présent manuscrit décrit les méthodes développées pour étudier les effets fonctionnels des variantes de RYR1 exprimées de manière endogène dans: (a) le virus d’Epstein Barr immortalisé les lymphocytes B humains et (b) les cellules satellites dérivées de biopsies musculaires et différenciées en myotubes. Les changements dans la concentration intracellulaire de calcium déclenchés par l’ajout d’un activateur pharmacologique RyR1 sont ensuite surveillés. Le type de cellule sélectionné est chargé d’un indicateur de calcium fluorescent ratiométrique et les changements intracellulaires [Ca2+]sont surveillés soit au niveau de la cellule unique par microscopie à fluorescence, soit dans les populations cellulaires à l’aide d’un spectrofluoromètre. Les courbes dose-réponse agoniste au repos [Ca2+] sont ensuite comparées entre les cellules de témoins sains et les patients hébergeant des variantes de RYR1, ce qui permet de mieux comprendre l’effet fonctionnel d’une variante donnée.
Introduction
À ce jour, plus de 700 variantes de RYR1 ont été identifiées dans la population humaine et liées à divers troubles neuromusculaires, notamment la susceptibilité à l’hyperthermie maligne (MHS), la rhabdomyolyse induite par l’exercice, la maladie du noyau central (CCD), la maladie multi-minicore (MmD), la myopathie centronucléaire (CNM)1,2,3 ; néanmoins, les études visant à caractériser leurs effets fonctionnels sont à la traîne et seulement environ 10% des mutations ont été testées fonctionnellement. Différentes approches expérimentales peuvent être utilisées pour évaluer l’impact d’une variante donnée de RyR1, y compris la transfection de cellules hétérologues telles que les cellules HEK293 et COS-7 avec un codage plasmidique pour le WT et l’ADNc4mutant RYR1,5,la transduction de fibroblastes de souris dyspédiques avec des plasmides et des vecteurs codant pour le WT et l’ADNc RYR1 mutant, suivie d’une transduction avec myo-D et d’une différenciation en myotubes6 , génération de modèles animaux transgéniques porteurs du mutant RyR1s7,8,9, caractérisation de cellules de patients exprimant la variante RYR1 de manière endogène10,11,12. De telles méthodes ont permis d’établir l’impact fonctionnel de différentes mutations sur le canal RyR1 Ca2+.
Ici, les méthodes développées pour évaluer les effets fonctionnels des mutations RYR1 sont décrites. Divers paramètres de l’homéostasie calcique intracellulaire sont étudiés dans des cellules humaines exprimant de manière endogène le canal calcique RyR1, y compris les myotubes et les lymphocytes B immortalisés par le virus d’Epstein Barr (EBV). Les cellules sont obtenues à partir de patients, développées en culture et chargées d’indicateurs de calcium fluorescents ratiométriques tels que Fura-2 ou indo-1. Les paramètres qui ont été signalés comme étant modifiés en raison de mutations pathogènes de RYR1, y compris le repos [Ca2+],la sensibilité à différents agonistes pharmacologiques et la taille des réserves intracellulaires de Ca2+ sont mesurés soit au niveau de la cellule unique, en utilisant la microscopie à fluorescence, soit dans les populations cellulaires à l’aide d’un fluorimètre. Les résultats obtenus dans les cellules des porteurs de mutations sont ensuite comparés à ceux obtenus auprès de membres sains de la famille témoin. Cette approche a démontré que : (i) de nombreuses mutations liées à la MHS entraînent une augmentation du repos [Ca2+] et un déplacement vers la gauche de la courbe dose-réponse à la dépolarisation induite par KCl ou à l’activation pharmacologique de RyR1 avec le 4-chloro-m-crésol10,11,12,13; (ii) les mutations liées au CCD entraînent une diminution du pic [Ca2+]libéré par l’activation pharmacologique du RyR1 et une diminution de la taille si le Ca2+ intracellulaire stocke12,13,14,15; (iii) certaines variantes n’ont pas d’impact sur l’homéostasie Ca2+13. Les avantages de cette approche expérimentale sont: la protéine RyR1 n’est pas surexprimée et des niveaux physiologiques sont présents, les cellules peuvent être immortalisées (à la fois les cellules musculaires et les lymphocytes B) fournissant des lignées cellulaires contenant des mutations. Certains inconvénients sont liés au fait que les patients peuvent être porteurs de mutations dans plus d’un gène codant pour des protéines impliquées dans l’homéostasie du calcium et / ou le couplage de contraction d’excitation (ECC), ce qui peut compliquer les conclusions expérimentales. Par exemple, deux variantes de JP-45 ont été identifiées dans la population MHS et témoin et leur présence a eu un impact sur la sensibilité du récepteur de la dihydropyridine (DHPR) à l’activation16. Les patients doivent être disponibles, le matériel biologique doit être fraîchement collecté et les permis éthiques doivent être obtenus auprès des conseils éthiques locaux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les protocoles décrits dans cet article ont été utilisés avec succès par plusieurs laboratoires pour étudier l’impact des mutations RYR1 sur l’homéostasie du calcium. Les étapes critiques des approches décrites dans le présent document portent sur la stérilité, les compétences et les techniques de culture cellulaire et la disponibilité du matériel biologique. En principe, l’utilisation des lymphocytes B immortalisés par l’EBV est plus simple et permet de générer des lignées cellulaires contenan…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les travaux décrits dans ce manuscrit ont été soutenus par des subventions du Fonds national suisse (FNS) et de la Fondation suisse du muscle.
Materials
| 4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
| Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| caffeine | Merk | 102584 | |
| Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
| Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
| Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Sigma | 41639 | |
| EGTA | Fluka | 3778 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
| Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Lanthanum | Fluka | 61490 | |
| Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
| Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
| Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
| Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
| Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
| Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |
Referências
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