내인성 표현 인간의 RYR1 변종의 기능적 특성화
Summary
여기서 엡스타인 바 바이러스에서 내인적으로 발현된 RYR1 돌연변이의 기능적 효과를 연구하는 데 사용되는 방법은 인간 B-림프구및 근육 생검 유래 위성 세포가 심투로 분화되어 설명된다.
Abstract
RYR1 유전자에 있는 700개 이상의 변이체는 악성 고열증 감수성, 코어 근병증 및 중핵 근병증을 포함하여 다른 신경 근육 무질서를 가진 환자에서 확인되었습니다. RYR1 돌연변이에 연결된 다양한 표현형 때문에 미래의 치료 내정간섭을 위해 환자에 의해 운반된 이체를 분류하고 비 병원성 이체를 확인하기 위하여 그들의 기능적인 효력을 특성화하는 것이 근본적입니다. 많은 실험실은 환자의 세포에서 발현된 RYR1 돌연변이를 기능적으로 특성화하는 방법을 개발하는 데 관심이 있습니다. 이 접근법은 돌연변이가 내인적으로 표현되고, RyR1은 과도하게 표현되지 않으며, 세포를 표현하는 이종성 RyR1의 사용은 피할 수 있습니다. 그러나, 환자가 RYR1을 제쳐두고 다른 유전자에 있는 돌연변이를 제출할 수 있기 때문에, 다른 유전 배경으로, 동일 돌연변이를 품고 있는 개별에게서 생물학 자료에서 결과를 비교하는 것이 중요합니다. 본 원고는 내인성 RYR1 변이체의 기능적 효과를 연구하기 위해 개발된 방법을 설명합니다: (a) 엡스타인 바 바이러스는 인간 B-림프구와 (b) 위성 세포가 근육 생검에서 파생되어 심튜브로 분화된다. 약리학 RyR1 활성제의 첨가에 의해 트리거된 세포내 칼슘 농도의 변경은 그 때 감시됩니다. 선택된 세포 유형은 형광칼슘 표시기와 세포내 [Ca2+]변화가 형광 현미경 검사법에 의해 또는 분광성계를 이용한 세포 집단에서 단일 세포 수준에서 모니터링된다. 휴식 [Ca2+],고뇌 용량 반응 곡선은 건강한 대조군에서 세포와 주어진 변이체의 기능적 효과에 대한 통찰력으로 이어지는 RYR1 변이체를 수용하는 환자 사이에서 비교됩니다.
Introduction
현재까지 700개 이상의 RYR1 변이체가 인간 인구에서 확인되었으며 악성 고열혈증(MHS), 운동 유도 래브도모분해증, 중앙핵심질환(CCD), 다중미니코어질환(MmD), 원핵근병증(CNM)1,2,3,3 ; 그럼에도 불구 하 고, 그들의 기능 효과 특성화 하는 연구는 뒤쳐지고 돌연변이의 단지 약 10%는 기능적으로 테스트 되었습니다. 다른 실험 적 접근 방식은 주어진 RyR1 변종의 영향을 평가하기 위해 사용될 수있다, WT 및 돌연변이 RYR1 cDNA4,5,WT 및 돌연변이 RYR1 cDNA에 대한 인코딩을 이용한 소화관 마우스 섬유아세포의 트랜스듀싱, 마이오-다이코-D-D-Tube로의 트랜스포메이션을 포함하는 등 이종세포의 이식 , 돌연변이 RyR1s7,8,9,RYR1 변종을 내인적으로10,11,12로표현하는 환자로부터 세포의 특성화를 운반하는 형질전환 동물 모델의 생성. 이러한 방법은 다른 돌연변이가 RyR1 Ca2+ 채널에 기능적으로 미치는 영향을 확립하는 데 도움이 되었습니다.
여기서, RYR1 돌연변이의 기능적 효과를 평가하기 위해 개발된 방법이 기재되어 있다. 세포내 칼슘 간이성의 다양한 매개 변수는 심오튜브및 엡스타인 바 바이러스(EBV) 불멸의 B-림프구를 포함하여 RyR1 칼슘 채널을 내인성으로 표현하는 인간 세포에서 조사됩니다. 세포는 환자로부터 얻어지며, 배양에서 확장되고 후라-2 또는 인도-1과 같은 형광칼슘 내감이 적재된다. 휴식 [Ca2+]를포함하는 병원성 RYR1 돌연변이로 인해 변경되는 것으로 보고된 파라미터는 상이한 약리학 작용제에 대한 민감도 및 세포내 Ca2+ 상점의 크기가 단일 세포 수준에서 측정되며, 형광 현미경 을 사용하거나, 불소계를 사용하는 세포 집단에서 측정된다. 돌연변이 운반대에서 세포에서 얻은 결과는 건강한 통제 가족 구성원에게서 얻은 것과 비교됩니다. 이러한 접근법은 (i) MHS에 연결된 많은 돌연변이가 휴식의 증가[Ca2+]및 KCl 유도탈극화 또는 약리학 RyR1 활성화에 대한 투여반응 곡선의 좌측으로의 이동을 4-클로로-m-cresol10,11,12,13으로유도하는 것으로 입증되었다. (ii) CCD에 연결된 돌연변이는 RyR1의 약리학적 활성화에 의해 방출된 피크 [Ca2+]의감소로 이어지고 세포내 Ca2+ 저장12, 13,14,15; (iii) 일부 변종은 Ca2 + 항상성(13)에영향을 미치지 않습니다. 이 실험적인 접근법의 장점은: RyR1 단백질은 과발현되지 않으며 생리학적 수준이 존재하며, 세포는 돌연변이를 포함하는 세포주를 제공하는 불멸(근육 세포 및 B-림프구 모두)이 존재할 수 있다. 몇몇 단점은 환자가 칼슘 항상성 및/또는 자궁 수축 커플링 (ECC)에 관련되되거나 흥분 수축 에 관련되되거나 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자에 있는 돌연변이를 전송할 수 있다는 사실과 관련이 있고 이것은 실험적인 결론을 복잡하게 할 수 있습니다. 예를 들어, 2개의 JP-45 변이체는 MHS 및 대조군 군수에서 확인되었고, 이들의 존재는 디하이드로피리딘 수용체(DHPR)의 감도에 영향을 미치는 것으로나타났다(16). 환자는 사용할 수 있어야, 생물학적 물질은 갓 수집할 필요가 있으며 윤리적 허가는 지역 윤리 위원회에서 얻을 필요가있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문에 기술된 프로토콜은 칼슘 항상성에 RYR1 돌연변이의 충격을 연구하기 위하여 몇몇 실험실에 의해 성공적으로 이용되었습니다. 이 논문에 설명된 접근법의 중요한 단계는 생물 물질의 불임, 세포 배양 기술 및 기술 및 가용성을 다룹니다. 원칙적으로 EBV-불멸의 B 림프구의 사용은 간단하며 돌연변이 RyR1 채널을 포함하는 세포주를 생성할 수 있습니다. 세포는 수년 동안 액체 질소에 동결및 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 원고에 설명 된 작품은 스위스 국립 과학 재단 (SNF)과 스위스 근육 재단의 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| 4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
| Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| caffeine | Merk | 102584 | |
| Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
| Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
| Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Sigma | 41639 | |
| EGTA | Fluka | 3778 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
| Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Lanthanum | Fluka | 61490 | |
| Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
| Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
| Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
| Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
| Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
| Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |
Referências
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