Schnelle Gittervorbereitung für zeitaufgelöste Kryo-Elektronenmikroskopie
Summary
Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die Verwendung eines schnellen Gitterherstellungsgeräts sowohl für die schnelle Gitterherstellung als auch für das schnelle Mischen und Einfrieren, um zeitaufgelöste Experimente durchzuführen.
Abstract
Das Gebiet der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) entwickelt sich rasant mit neuer Hardware und Verarbeitungsalgorithmen, die Strukturen mit höherer Auflösung und Informationen über anspruchsvollere Systeme erzeugen. Die Probenvorbereitung für Kryo-EM erlebt eine ähnliche Revolution, wobei neue Ansätze entwickelt werden, um die traditionellen Blotting-Systeme zu ersetzen. Dazu gehören der Einsatz von piezoelektrischen Spendern, Pin-Druck und Direktspritzen. Als Ergebnis dieser Entwicklungen steigt die Geschwindigkeit der Netzvorbereitung von Sekunden auf Millisekunden, was neue Möglichkeiten bietet, insbesondere im Bereich der zeitaufgelösten Kryo-EM, wo Proteine und Substrate schnell gemischt werden können, bevor sie einfrieren und kurzlebige Zwischenzustände einfangen. Hier beschreiben wir im Detail ein Standardprotokoll zur Erstellung von Gittern auf unserem hauseigenen zeitaufgelösten EM-Gerät sowohl für die standardmäßige schnelle Netzvorbereitung als auch für zeitaufgelöste Experimente. Das Protokoll erfordert mindestens etwa 50 μL Proben in Konzentrationen von ≥ 2 mg/ ml für die Herstellung von 4 Gittern. Die Verzögerung zwischen Probenanwendung und Einfrieren kann bis zu 10 ms beträgen. Eine Einschränkung ist die erhöhte Eisdicke bei höheren Geschwindigkeiten und im Vergleich zur Blotting-Methode. Wir hoffen, dass dieses Protokoll anderen helfen wird, ihre eigenen Grid-Making-Geräte zu entwerfen und diejenigen, die an der Entwicklung zeitaufgelöster Experimente interessiert sind.
Introduction
Hintergrund
Jüngste Entwicklungen in der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) haben Strukturstudien von immer komplexeren Systemen mit hoher Auflösung ermöglicht. Mit wenigen Ausnahmen beschränkten sich solche Studien auf biologische Makromoleküle im Gleichgewicht1 oder relativ langsame Reaktionen2. Viele Prozesse in vivo laufen auf einer schnelleren Zeitskala (Millisekunden) ab und es besteht ein zunehmendes Interesse an zeitaufgelöster Kryo-EM (TrEM) auf diesen Zeitskalen3. Die herkömmliche Kryo-EM-Probenvorbereitung durch die Blotting-Methode ist jedoch zu langsam für Millisekunden-TrEM.
Die Blotting-Methode hat neben der schlechten Zeitauflösung noch andere Einschränkungen. Proteine und Proteinkomplexe können unter Denaturierung oder bevorzugter Orientierung auf Gitternleiden 4. Es hat sich gezeigt, dass die Verringerung der Expositionszeit gegenüber der Luft-Wasser-Grenzfläche während der Probenvorbereitung die bevorzugte Orientierung und Proteindenaturierung verringert5,6. So ermöglicht eine schnelle Netzvorbereitung nicht nur Millisekunden-TrEM, sondern kann auch die Netzqualität verbessern.
Derzeit gibt es drei verschiedene Ansätze zur automatisierten Netzvorbereitung. Der erste Ansatz verwendet einen Stift oder eine Kapillare, die eine kleine Menge an Probe enthält. Nach der Herstellung des Kontakts zwischen der Flüssigkeit und der Gitteroberfläche wird die Probe auf das Gitter7,8“geschrieben”. Der Beispielantragsprozess ist relativ langsam und dauert einige Sekunden. Ein alternativer Ansatz verwendet die kontrollierte Tröpfchenerzeugung durch einen Piezospender und selbstableitende Gitter9. Dies ermöglicht schnellere Dosier- bis Gefrierzeiten, ist aber immer noch durch Tröpfchen- und Dochtgeschwindigkeit begrenzt (derzeit 54 ms). Der bisher schnellste Ansatz ist der direkte Sprühansatz, bei dem die Probe in einer Sprühdüse zerstäubt wird und sich die kleinen (~ 10 – 20 μm) und schnellen (> 5 m/s) Tröpfchen bei Kontakt mit dem Kryo-EM-Gitter ausbreiten. Das Probenspray kann auf verschiedene Arten wie Luftstrahlzerstäuber, oberflächenakustische Wellen oder Ultraschallbefeuchter10 , 11,12,13erzeugt werden. Nach unserer Erfahrung ist die Eisdicke beim direkten Sprühansatz größer, aber das direkte Sprühen ermöglicht das Dosieren gefrieren < 10 ms.
Dieses Protokoll beschreibt Schritt für Schritt, wie ein zeitaufgelöstes EM-Gerät (TED), das mit einer mikrofluidischen Sprühdüse ausgestattet ist, verwendet werden kann, um Gitter auf einer schnellen Zeitskalavorzubereiten 14,15. Das Gerät wurde verwendet, um Gitter mit einer minimalen Verzögerungszeit von 6 ms zwischen Probenanwendung und Einfrieren vorzubereiten und zwei Proben schnell zu mischen und einzufrieren. Das Design des TED basiert auf einer Vorgängerversion16 und ähnelt anderen sprühbasierten zeitaufgelösten Kryo-EM-Geräten17.
Zunächst werden die vier Hauptteile des TED-Setups beschrieben. Das Herzstück des TED ist die Liquid Handling Unit, die für die Probenabsaugung und -dosierung zuständig ist. Ein pneumatischer Kolben bewegt das Gitter durch das Spray in das flüssige Ethan. Die Erzeugung des Sprays erfolgt mit mikrofluidischen Sprühdüsen und das Einfrieren erfolgt in einem flüssigen Ethanbehälter, die kurz beschrieben werden. Schließlich werden die zusätzlichen Funktionen zur Steuerung der Netzumgebung, insbesondere der Luftfeuchtigkeit, hervorgehoben. Es folgen detaillierte Protokolle für den Betrieb des Gerätes und für die Durchführung von TrEM-Experimenten. Repräsentative Ergebnisse werden für eine schnelle Netzvorbereitung und ein einfaches TrEM-Experiment gegeben.
Versuchsaufbau
Die Liquid-Handling-Einheit
Das Liquid-Handling-System des TED besteht aus drei Spritzenantriebspumpen (“Pumpen 1 – 3”), die jeweils mit einer Zellenradschleuse ausgestattet sind (Abbildung 1). Ein Netzteil versorgt die Pumpen 1 – 3 mit 24 V DC. Die Kommunikation mit der Steuerungssoftware (geschrieben in Visual Basic und C++) erfolgt über eine RS232-Schnittstelle zu Pump 1. Die Befehle werden über die seriellen E/A-Erweiterungsports von Pumpe 1 bis Pumpen 2-3 verteilt. Die Pumpen 1-3 sind mit Glasspritzen ausgestattet (‘Spritzen 1-3’, wir verwenden hier 250 μL/Null Totvolumen spritzen). Jedes Ventil hat zwei Positionen, “Load” und “Dispense”. Die “Last”-Position wird verwendet, um die Probe in die Spritze abzusaugen. Ein kurzes Stück (~ 3 – 4 cm) aus 1/16″ O.D., 0,01′′ I.D. FEP-Schläuchen ist über ETFE/ETFE-Flansch-Verschlussstücke mit der “Last”-Position der Ventile 1-3 verbunden. Dieses kurze Stück Schlauch reicht in das Probenreservoir (typischerweise ein 1,5 ml oder 0,5 ml Kunststoffröhrchen). Die “Dispense”-Position führt zur Sprühdüse. Die Verbindung zwischen dem “Dispense”-Auslass und der Sprühdüse erfolgt durch PE-Schläuche (~ 20-30 cm Länge, 0,043″ O.D., 0,015″ I.D.), mit einem kurzen Stück Hülsenschlauch (~ 0,5 cm) und ETFE/ETFE-Flansch-Fittings.
Der pneumatische Kolben
Der TED verwendet einen pneumatischen Kolben, um das Gitter zu beschleunigen und es durch das Probenspray in den flüssigen Ethanbehälter zu bewegen. Eine Unterdruckpinzette hält das Gitter, das in eine selbstgebaute Halterung geschraubt wird, die an einem Doppelstab-Pneumatikzylinder montiert ist (Abbildung 2A).
Der Druck wird von einer großen Stickstoffgasflasche (Größe W) geliefert, die mit einem mehrstufigen Regler (0 – 10 bar, “Hauptdruck”) ausgestattet ist. Flexibler verstärkter PVC-Schlauch (12 mm O.D.) verbindet den Regler mit einem 12-Port-Verteiler, in dem unter Druck stehender Stickstoff an die Düse und den pneumatischen Kolben abgegeben wird. Der Gasfluss durch die Düse ist konstant und wird direkt am Stickstoffzylinder geregelt (Hauptdruck). Die Verbindung zur Düse erfolgt mit PU-Schläuchen (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.), einem kurzen Stück PE-Schlauch (~ 8 cm Länge, 0,043″ O.D., 0,015″ I.D.) und entsprechenden Anschlüssen. Der Druck auf den pneumatischen Kolben wird über ein Magnetventil gesteuert. PU-Schläuche (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.) verbinden das Magnetventil mit einem Regler und dem pneumatischen Kolben, um einen reduzierten Tauchdruck (≤ Hauptdruck) zu ermöglichen. Das Magnetventil ist computergesteuert. Eine schematische Übersicht über das Setup finden Sie in Abbildung 2B.
Beachten Sie, dass bei diesem Setup der Tauchdruck immer gleich oder kleiner als der Sprühgasdruck (Hauptdruck) ist. Das Setup kann jedoch leicht geändert werden, indem ein zweiter Regler vor der Sprühdüse integriert wird, um höhere Tauchgeschwindigkeiten bei niedrigem Sprühgasdruck zu ermöglichen. Hohe Drücke (>> 2 bar) können die PDMS-Sprühdüse beschädigen.
ACHTUNG: Dies ist ein Drucksystem und der “Hauptdruck” sollte immer < 7 bar betragen.
Für den pneumatischen Kolben werden typischerweise Drücke zwischen 0,5 und 2 bar verwendet und zeigen ein annähernd lineares Verhältnis zwischen Druck und Geschwindigkeit (an der vertikalen Position des Sprays). Tauchgeschwindigkeiten werden mit einem Oszilloskop gemessen, das mit einem Schiebepotentiometer (10 kΩ) und parallel mit einem 2 kΩ-Widerstand verbunden ist(Abbildung 2C). Ein Netzteil versorgt das Potentiometer mit 9 V DC. Während die ungefähre Tauchgeschwindigkeit vor dem Experiment durch Einstellen des Tauchdrucks eingestellt wird, liefert das Potentiometer eine genaue Ablesung der Geschwindigkeit nach dem Experiment.
Sprühdüsen und Flüssigethanbehälter
Die Herstellung und der Betrieb gasdynamischer virtueller Düsen für die sprühbasierte Probenabgabe wurde an anderer Stelle ausführlich beschrieben15. Wie oben beschrieben, sind die “Dosierauslässe” der Ventile 1-3 mit den Flüssigkeitseinlässen der Düse verbunden (Abbildung 3A). Das unter Druck stehende Sprühgas wird mit dem Gaseinlass der Düse verbunden. Die Einlässe in den PDMS-Sprühdüsen sind so, dass 0,043″ O.D. PE-Schläuche direkt ohne Armaturen verwendet werden können. Unser Düsendesign enthält eine “Jet-in-Jet”-Geometrie zum Mischen von zwei Proben, ähnlich der in Referenz 18 beschriebenenVorrichtung. Ein Schema des Designs ist in Abbildung 3Bdargestellt, ein mikroskopisches Bild einer Düse ist in Abbildung 3Cdargestellt. Das Layout des mikrofluidischen Geräts erfordert die Verwendung von drei Spritzen, um zwei Proben zu mischen. Die Sprühdüse wird typischerweise in 1-1,5 cm Abstand vom Gitter positioniert (während der Probenanwendung).
Wir verwenden flüssiges Ethan als Kryogen in einem flüssigen Ethan/ Stickstoffbehälter, wie es für die Standard-Blotting-Methode verwendet wird. Die vertikale Positionierung des flüssigen Ethanbechers wird mit einer Laborhebebühne erreicht.
Steuerung der Sprüh- und Gitterumgebung
Der Kolben und die Sprühdüse sind in einer speziell angefertigten PMMA-Box (Acrylglas) mit einer Doppeltür enthalten (Abbildung 4A). Eine hohe relative Luftfeuchtigkeit im Inneren der Box wird durch ein Luftbefeuchtungssystem an der Rückseite des TED erreicht (Abbildung 4B). Die Luft wird von einer Pumpe zugeführt und in einen ersten 10-Zoll-Kanister (typischerweise für die Reinigung von Wasser unter der Spüle verwendet) eingespeist. Der Kanister ist mit einem niedrigen Wasserstand (~ 5-10 cm) gefüllt und beherbergt auch eine Luftbefeuchtereinheit. Die Stromversorgung des Luftbefeuchters wird über einen digitalen Feuchtigkeits-/Temperaturregler und einen Feuchtigkeits-/Temperatursensor im Inneren der Acrylglasbox gesteuert. Der Regler ist so eingestellt, dass die Pumpe ausgeschaltet wird, wenn die relative Luftfeuchtigkeit ≥ 90 % erreicht. Befeuchtete Luft aus dem ersten Kanister wird durch einen Diffusor gepumpt, in einem zweiten 10-Zoll-Kanister in Wasser getaucht und gelangt dann in den Acrylglaskasten.
ACHTUNG: Da die Probe in der Sprühdüse aerosolisiert wird, sind gefährliche biologische oder chemische Proben nicht als Proben geeignet.
Die Laufsequenz
Die Schaltfläche Skript ausführen in der Steuerungssoftware initiiert die Ausführungssequenz. Diese Befehlsfolge kann in einer Skriptdatei vordefiniert und durch die Software verändert werden. Die wichtigsten Variablen werden hier erklärt:
Sprühgeschwindigkeit: Die Sprühgeschwindigkeit bestimmt den Flüssigkeitsdurchfluss, der von der Spritzenpumpe verwendet wird. Der Durchfluss kann wie folgt berechnet werden: Die hier eingesetzten Spritzenpumpenmotoren haben eine feste Schrittgröße. Die gesamte Palette der Pumpe ist in 48.000 Schritte unterteilt. Der zweite wichtige Faktor ist das Spritzenvolumen. Wir verwenden typischerweise 250 μL Spritzen. Die Sprühgeschwindigkeit in der Steuerungssoftware wird als Anzahl der Schritte/Sekunde eingestellt. Eine Sprühgeschwindigkeit von 1000 Schritten/Sekunde entspricht:
Sprühvolumen: Das Sprühvolumen bestimmt das zu sprühene Gesamtvolumen. Somit bestimmt es auch die Dauer des Sprays. Die Sprühmenge in der Steuerungssoftware wird in mehreren Schritten eingestellt. Ein Sprühvolumen von 2000 Schritten, bei einer Sprühgeschwindigkeit von 1000 Schritten/Sekunde, führt zu einer Sprühdauer von 2 s und einem Gesamtvolumen von 10,4 μL.
Vorsprühzeit: Diese Variable definiert die Zeit zwischen dem Beginn des Sprays und dem Eintauchen. Es ist wichtig, die Verzögerungszeit so zu wählen, dass das Spray genügend Zeit hat, sich zu stabilisieren, bevor es das Gitter eintaucht. Normalerweise wird dem Spray 1,5 – 4 s gegeben, um sich zu stabilisieren, bevor das Gitter eingetaucht wird. Das Spray wird so lange aufrechterhalten, bis sich das Gitter durchbewegt hat. Normalerweise wird der Flüssigkeitsfluss (und damit das Spray) 0,5 bis 1 s gestoppt, nachdem das Gitter eingetaucht wurde. Bei einer Sprühgeschwindigkeit von 1000 Schritten/s und einem Sprühvolumen von 2000 Schritten beträgt eine typische Vorsprühzeit beispielsweise 1,5 s.
Eine beispielhafte Abfolge von Befehlen ist in Abbildung 5Adargestellt, die Rasterposition über die Zeit ist in Abbildung 5Bdargestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Protokolle in dieser Arbeit können für eine schnelle Gittervorbereitung durch direktes Sprühen und TrEM-Experimente verwendet werden. Die schnelle Gittervorbereitung kann verwendet werden, um Partikelwechselwirkungen mit der Luftwasserschnittstelle zu reduzieren5. Die Haupteinschränkungen sind die verfügbare Probenkonzentration und die Eisdicke auf dem Gitter. Innerhalb dieser Grenzen und unter der Voraussetzung, dass die Probenqualität gut ist, erzeugt das Protokoll Gitter, die für hoc…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Molly S.C. Gravett für hilfreiche Gespräche und den Mitarbeitern der ABSL-Einrichtung für die Hilfe bei der Kryo-EM-Datenerfassung. David P. Klebl ist Doktorand des 4-jährigen Wellcome Trust PhD-Programms im Astbury Centre, das von der University of Leeds finanziert wird. Die FEI Titan Krios Mikroskope wurden von der University of Leeds (UoL ABSL Award) und Wellcome Trust (108466/Z/15/Z) finanziert. Diese Arbeit wurde durch ein BBSRC-Stipendium an Stephen P. Muench (BB/P026397/1) und durch Forschungsstipendien an Howard D. White von der American Heart Association (AMR21-236078) und Howard D. White und Vitold Galkin von den US-amerikanischen National Institutes of Health (171261) unterstützt.
Materials
| Time resolved device | |||
| acrylic glass box | USA scientific | ||
| digital humidity/temperature controller | THE20 digital humidity/temperature controller | ||
| dual rod pneumatic cylinder | dual rod pneumatic cylinder TN 10×70 | ||
| FEP tubing | Upchurch Scientific 1/16” O.D., 0.01'' I.D. FEP tubing | ||
| flangeless fittings | Upchurch Scientific ETFE/ETFE flangeless fittings | ||
| flexible reinforced PVC tubing | 12 mm OD. flexible reinforced PVC tubing | ||
| glass syringes | Kloehn 250 µL zero-dead volume | ||
| humidifier pump | Interpret Aqua Air AP3 | ||
| liquid ethane container | from Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV | ||
| multistage regulator | GASARC class 3 multistage regulator | ||
| negative pressure tweezers | Dumont N5 Inox B negative pressure tweezers | ||
| oscilloscope | Hantek 6022BE oscilloscope | ||
| PE tubing | Scientific Commodities Inc. 0.043” O.D., 0.015” I.D. PE tubing | ||
| power supply | Mean Well GSM160A24-R7B | ||
| power supply | Wanptek KPS305D power supply | ||
| PU tubing | SMC TU0425 4 mm O.D., 2.5 mm I.D. PU tubing | ||
| regulator | Norgren R72G-2GK-RMN | ||
| slide potentiometer | PS100 slide potentiometer | ||
| solenoid valve | SMC NVJ314M solenoid valve | ||
| syringe drive pumps | Kloehn V6 48K model | ||
| Reagents & Materials | |||
| apoferritin from equine spleen | Sigma-Aldrich, A3660 | ||
| ATP | Sigma-Aldrich, A2383 | ||
| cryo-EM grids | Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3 | ||
| EGTA | Sigma Aldrich E3889 | ||
| F-actin | Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 1) | ||
| glow-discharger | Cressington 208 carbon coater with a glow-discharge unit | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich, H7006 | ||
| KAc | Sigma-Aldrich, P1190 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, M8266 | ||
| MOPS | Sigma-Aldrich, M1254 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich, S9888 | ||
| Skeletal muscle myosin S1 | Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 2) | ||
| Ref 1 | Spudich, J. A. & Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of biological chemistry 246, 4866-4871 (1971). | ||
| Ref 2 | White, H. & Taylor, E. Energetics and mechanism of actomyosin adenosine triphosphatase. Bioquímica 15, 5818-5826 (1976). |
Referências
- Murphy, B. J., et al. Rotary substates of mitochondrial ATP synthase reveal the basis of flexible F1-Fo coupling. Science. 364, (2019).
- Benton, D. J., Gamblin, S. J., Rosenthal, P. B., Skehel, J. J. Structural transitions in influenza haemagglutinin at membrane fusion pH. Nature. , 1-4 (2020).
- Dance, A. Molecular motion on ice. Nature Methods. , 1-5 (2020).
- D’Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
- Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nature Methods. 15, 793-795 (2018).
- Klebl, D. P., et al. Need for speed: Examining protein behaviour during cryoEM grid preparation at different timescales. BioRxiv. , (2020).
- Ravelli, R. B., et al. Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification. Nature Communications. 11, 1-9 (2020).
- Arnold, S. A., et al. Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts. Journal of Structural Biology. 197, 220-226 (2017).
- Razinkov, I., et al. A new method for vitrifying samples for cryoEM. Journal of Structural Biology. 195, 190-198 (2016).
- Feng, X., et al. A fast and effective microfluidic spraying-plunging method for high-resolution single-particle cryo-EM. Structure. 25, 663-670 (2017).
- Ashtiani, D., et al. Delivery of femtolitre droplets using surface acoustic wave based atomisation for cryo-EM grid preparation. Journal of Structural Biology. 203, 94-101 (2018).
- Rubinstein, J. L., et al. Shake-it-off: a simple ultrasonic cryo-EM specimen-preparation device. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75, (2019).
- Mäeots, M. -. E., et al. Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM. Nature Communications. 11, 1-14 (2020).
- Kontziampasis, D., et al. A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies. IUCrJ. 6, (2019).
- Klebl, D. P., et al. Sample deposition onto cryo-EM grids: from sprays to jets and back. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 76, (2020).
- White, H., Thirumurugan, K., Walker, M., Trinick, J. A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray. Journal of Structural Biology. 144, 246-252 (2003).
- Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. . Protein Complex Assembly. , 59-71 (2018).
- Trebbin, M., et al. Microfluidic liquid jet system with compatibility for atmospheric and high-vacuum conditions. Lab on a Chip. 14, 1733-1745 (2014).
- Klebl, D. P., Sobott, F., White, H. D., Muench, S. P. On-grid and in-flow mixing for time-resolved Cryo-EM. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. , (2021).
- He, S., Scheres, S. H. Helical reconstruction in RELION. Journal of Structural Biology. 198, 163-176 (2017).
- Millar, N. C., Geeves, M. A. The limiting rate of the ATP-mediated dissociation of actin from rabbit skeletal muscle myosin subfragment 1. FEBS Letters. 160, 141-148 (1983).
- Kasas, S., Dumas, G., Dietler, G., Catsicas, S., Adrian, M. Vitrification of cryoelectron microscopy specimens revealed by high-speed photographic imaging. Journal of Microscopy. 211, 48-53 (2003).
- Glaeser, R. M., et al. Defocus-dependent Thon-ring fading. bioRxiv. , (2020).
- Bagshaw, C. A beginner’s guide to flow kinetics. The Biochemist. 42, (2020).
