Preparação rápida da grade para microscopia crio-elétron resolvida pelo tempo
Summary
Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para o uso de um dispositivo de fabricação de grade rápida tanto para a fabricação rápida de grade quanto para a rápida mistura e congelamento para realizar experimentos resolvidos pelo tempo.
Abstract
O campo da microscopia crio-elétron (crio-EM) está se desenvolvendo rapidamente com novos algoritmos de hardware e processamento, produzindo estruturas de maior resolução e informações sobre sistemas mais desafiadores. A preparação da amostra para crio-EM está passando por uma revolução semelhante com novas abordagens sendo desenvolvidas para substituir os sistemas tradicionais de manchas. Estes incluem o uso de distribuidores piezo-elétricos, impressão de pinos e pulverização direta. Como resultado desses desenvolvimentos, a velocidade de preparação da rede está indo de segundos a milissegundos, proporcionando novas oportunidades, especialmente no campo do crio-EM resolvido no tempo, onde proteínas e substratos podem ser rapidamente misturados antes do congelamento do mergulho, prendendo estados intermediários de curta duração. Aqui descrevemos, em detalhes, um protocolo padrão para fazer grades em nosso dispositivo EM resolvido no tempo interno, tanto para preparação padrão de grade rápida quanto para experimentos resolvidos com o tempo. O protocolo requer um mínimo de cerca de 50 μL de amostra em concentrações de ≥ 2 mg/mL para a preparação de 4 grades. O atraso entre aplicação da amostra e congelamento pode ser tão baixo quanto 10 ms. Uma limitação é o aumento da espessura do gelo em velocidades mais rápidas e comparado com o método de mancha. Esperamos que este protocolo ajude outros a projetar seus próprios dispositivos de fabricação de grade e aqueles interessados em projetar experimentos resolvidos com o tempo.
Introduction
Fundo
Desenvolvimentos recentes na microscopia crio-elétron (crio-EM) permitiram estudos estruturais de sistemas cada vez mais complexos em alta resolução. Com poucas exceções, tais estudos têm sido limitados a macromoléculas biológicas em equilíbrio1 ou reações relativamente lentas2. Muitos processos in vivo ocorrem em uma escala de tempo mais rápida (milissegundos) e há um interesse crescente em crio-EM (TrEM) resolvidos no tempo nessas escalas de tempo3. No entanto, a preparação convencional da amostra crio-EM pelo método de manchas é muito lenta para o TrEM de milissegundo.
O método de mancha tem outras limitações além da baixa resolução de tempo. Proteínas e complexos proteicos podem sofrer de desnaturação ou orientação preferencial nas redes4. A redução do tempo de exposição à interface ar-água durante a preparação da amostra tem sido demonstrada para mitigar a orientação preferida e a desnaturação proteica5,6. Assim, a preparação rápida da grade não só permite o TrEM de milissegundos, mas também pode melhorar a qualidade da grade.
Atualmente, existem três abordagens diferentes para a preparação automatizada da rede. A primeira abordagem usa um pino ou capilar que contém uma pequena quantidade de amostra. Após estabelecer contato entre o líquido e a superfície da grade, a amostra é ‘escrita’ na grade7,8. O processo de aplicação da amostra é relativamente lento e leva alguns segundos. Uma abordagem alternativa usa a geração de gotículas controladas por um distribuidor piezo e grades auto-wicking9. Isso permite dispensar mais rapidamente os tempos de congelamento, mas ainda é limitado pela velocidade de gotícula e pavio (atualmente atingindo 54 ms). A abordagem mais rápida até agora é a abordagem direta de pulverização, na qual a amostra é atomizada em um bocal de spray e as gotículas pequenas (~ 10 – 20 μm) e rápidas (> 5 m/s) espalhadas após o contato com a grade crio-EM. O spray de amostra pode ser gerado de diferentes maneiras, como atomizadores do airblast, ondas acústicas de superfície ou umidificadores ultrassônicos10,11,12,13. Em nossa experiência, a espessura do gelo com a abordagem de pulverização direta é maior, mas a pulverização direta permite dispensar vezes < 10 ms.
Este protocolo descreve passo a passo como um dispositivo EM (TED) resolvido com o tempo equipado com um bocal de pulverização microfluido pode ser usado para preparar grades em uma escala de tempo rápida14,15. O dispositivo tem sido usado para preparar grades com um tempo mínimo de atraso de 6 ms entre aplicação da amostra e congelamento e para misturar e congelar rapidamente duas amostras. O design do TED é baseado em uma versão anterior16 e é semelhante a outros dispositivos crio-EM resolvidos com spray17.
Primeiro, as quatro partes principais da configuração TED são descritas. O núcleo do TED é a unidade de manuseio líquido, que é responsável pela aspiração e dispensação da amostra. Um êmbolo pneumático move a grade através do spray para o etano líquido. A geração do spray é alcançada com bicos de spray microfluidos e o congelamento é feito em um recipiente de etano líquido, que são descritos brevemente. Por fim, destacam-se as características adicionais para controlar o ambiente da rede, especialmente a umidade. Isso é seguido por protocolos detalhados para o funcionamento do dispositivo e para a realização de experimentos TrEM. Os resultados representativos são dados para a preparação rápida da grade e um simples experimento TrEM.
Configuração experimental
A unidade de manuseio líquido
O sistema de manuseio líquido do TED é formado por três bombas de acionamento de seringa (‘bombas 1 – 3’), cada uma equipada com uma válvula rotativa(Figura 1). Uma fonte de alimentação fornece bombas 1 – 3 com DC 24 V. A comunicação com o software de controle (escrito em Visual Basic e C++) é através de uma interface RS232 para bombear 1. Os comandos são distribuídos através das portas de expansão de I/O serial da bomba 1 às bombas 2-3. As bombas 1-3 são equipadas com seringas de vidro (seringas de vidro 1-3′, usamos 250 seringas de volume morto 250 μL/zero aqui). Cada válvula tem duas posições, ‘carregar’ e ‘dispensar’. A posição ‘carga’ é usada para aspirar amostra na seringa. Uma peça curta (~ 3 – 4 cm) de 1/16″ O.D., 0,01′′ A tubulação FEP é conectada através de encaixes ETFE/ETFE flangeless à posição de ‘carga’ das válvulas 1-3. Este pequeno pedaço de tubulação atinge o reservatório de amostras (tipicamente um tubo plástico de 1,5 mL ou 0,5 mL). A posição ‘dispensar’ leva ao bocal de pulverização. A conexão entre a tomada ‘dispense’ e o bocal de spray é feita por tubos pe (~ 20-30 cm de comprimento, 0,043″ O.D., 0,015″ I.D.), com um pequeno pedaço de tubo de manga (~ 0,5 cm) e encaixes etfe/ETFE flangeless.
O êmbolo pneumático
O TED usa um êmbolo pneumático para acelerar a rede e movê-la através do spray de amostra para o recipiente de etano líquido. Pinças de pressão negativa seguram a grade, aparafusadas em um suporte construído em casa que é montado em um cilindro pneumático de haste dupla(Figura 2A).
A pressão é fornecida a partir de um grande cilindro de gás nitrogênio (tamanho W), equipado com um regulador multiestáquia (0 -10 bar, ‘pressão principal’). A tubulação de PVC reforçado flexível (12 mm O.D.) conecta o regulador a um coletor de 12 portas onde o nitrogênio pressurizado é entregue ao bocal e ao êmbolo pneumático. O fluxo de gás através do bocal é constante, regulado diretamente no cilindro de nitrogênio (pressão principal). A conexão com o bocal é feita com tubos PU (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.), um pequeno pedaço de tubo de PE (~ 8 cm de comprimento, 0,043″ O.D., 0,015″ I.D.) e conectores apropriados. A pressão no êmbolo pneumático é controlada através de uma válvula solenoide. O tubo PU (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.) conecta a válvula solenoide com um regulador e o êmbolo pneumático, para permitir uma pressão de mergulho reduzida (≤ pressão principal). A válvula solenoide é controlada por computador. Uma visão geral esquemática da configuração é dada na Figura 2B.
Observe que com esta configuração a pressão de mergulho é sempre igual ou menor do que a pressão do gás de pulverização (pressão principal). No entanto, a configuração pode ser facilmente alterada incorporando um segundo regulador a montante do bocal de pulverização para permitir velocidades de mergulho mais altas em baixa pressão de gás de pulverização. Altas pressões (>> 2 barras) podem danificar o bocal de spray PDMS.
ATENÇÃO: Trata-se de um sistema pressurizado e a “pressão principal” deve ser sempre < 7 bar.
Pressões entre 0,5 e 2 barras são tipicamente usadas para o êmbolo pneumático e mostram uma relação aproximadamente linear entre pressão e velocidade (na posição vertical do spray). As velocidades de mergulho são medidas com um osciloscópio, conectado em linha com um potencializador de slides (10 kΩ) e em paralelo com um resistor de 2 kΩ(Figura 2C). Uma fonte de alimentação fornece o potencialiômetro com 9 V DC. Enquanto a velocidade de mergulho aproximada é definida antes do experimento, definindo a pressão de mergulho, o potencialiômetro dá uma leitura precisa da velocidade após o experimento.
Bicos de spray e recipiente de etano líquido
A fabricação e operação de bicos virtuais dinâmicos a gás para entrega de amostras baseadas em spray foi descrita em outros lugares no detalhe15. Como descrito acima, as saídas ‘dispensar’ das válvulas 1-3 estão conectadas às entradas líquidas do bocal(Figura 3A). O gás pressurizado está conectado à entrada de gás do bocal. As entradas nos bicos de spray PDMS são tais que a tubulação de PE de 0,043″ pode ser usada diretamente sem a necessidade de conexões. Nosso design de bocal contém uma geometria “jet-in-jet” para a mistura de duas amostras, semelhante ao dispositivo descrito no ref.18. Um esquema do design é mostrado na Figura 3B, uma imagem microscópica de um bocal é mostrada na Figura 3C. O layout do dispositivo microfluido requer o uso de três seringas para misturar duas amostras. O bocal de pulverização é normalmente posicionado a 1-1,5 cm de distância da grade (durante a aplicação da amostra).
Usamos etano líquido como criogen, em um recipiente líquido de etano/nitrogênio, como usado para o método padrão de manchas. O posicionamento vertical do copo de etano líquido é alcançado com uma plataforma de elevação de laboratório.
Controle do ambiente de pulverização e grade
O bocal de êmbolo e spray estão contidos dentro de uma caixa pmma personalizada (vidro acrílico) com uma porta dupla(Figura 4A). A alta umidade relativa dentro da caixa é alcançada por um sistema de umidificação do ar na parte de trás do TED (Figura 4B). O ar é fornecido por uma bomba e alimentado em um primeiro recipiente de 10″ (normalmente usado para purificação de água do pia). O recipiente é preenchido com um nível baixo (~ 5-10 cm) de água e também abriga uma unidade umidificador. A potência da rede do umidificador é controlada por um controlador de umidade/temperatura digital e um sensor de umidade/temperatura localizado dentro da caixa de vidro acrílico. O controlador está pronto para desligar a bomba quando a umidade relativa atingir ≥ 90 %. O ar umidificado do primeiro recipiente é bombeado através de um difusor, imerso em água em um segundo recipiente de 10″ e, em seguida, entra na caixa de vidro acrílico.
ATENÇÃO: Como a amostra é aerossolizada no bocal de spray, amostras biológicas ou químicas perigosas não são adequadas como amostras.
A sequência de execução
O botão Executar script no software de controle inicia a sequência de execução. Esta sequência de comandos pode ser pré-definida em um arquivo de script e alterada através do software. As variáveis mais importantes são explicadas aqui:
Velocidade do spray: A velocidade do pulverizador determina a taxa de fluxo de líquido usada pela bomba de seringa. A taxa de fluxo pode ser calculada da seguinte forma: Os motores da bomba de seringa utilizados aqui têm um tamanho de passo fixo. A gama completa da bomba é dividida em 48.000 passos. O segundo fator importante é o volume da seringa. Normalmente usamos seringas de 250 μL. A velocidade de pulverização no software de controle é definida como número de passos/segundo. Uma velocidade de pulverização de 1000 passos/segundo corresponde a:
Volume de pulverização: O volume do spray determina o volume total a ser pulverizado. Assim, também determina a duração do spray. O volume de pulverização no software de controle é definido como uma série de etapas. Um volume de pulverização de 2000 passos, a uma velocidade de pulverização de 1000 passos/segundo, leva a uma duração de pulverização de 2 s e um volume total de 10,4 μL.
Tempo de pré-pulverização: Esta variável define o tempo entre o início do spray e o mergulho. É importante escolher o tempo de atraso para que o spray tenha tempo suficiente para estabilizar antes de mergulhar na grade. Normalmente, o spray é dado 1,5 – 4 s para estabilizar antes que a grade seja mergulhada. O spray é mantido até que a rede se move. Normalmente, o fluxo líquido (e, portanto, o spray) é interrompido de 0,5 a 1 s depois que a rede foi mergulhada. Usando uma velocidade de pulverização de 1000 passos/s e um volume de spray de 2000 passos, um tempo típico de pré-pulverização é de 1,5 s, por exemplo.
Uma sequência exemplar de comandos é mostrada na Figura 5A, a posição da grade ao longo do tempo é ilustrada na Figura 5B.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os protocolos neste trabalho podem ser usados para preparação rápida da grade por pulverização direta e experimentos TrEM. A preparação rápida da grade pode ser usada para reduzir as interações de partículas com a interface de água do ar5. As principais limitações são a concentração amostral disponível e a espessura do gelo na rede. Dentro desses limites e desde que a qualidade da amostra seja boa, o protocolo produz grades adequadas para crio-EM de alta resolução.
<p class…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Molly S.C. Gravett por discussões úteis e a equipe de instalações da ABSL por ajuda com a coleta de dados crio-EM. David P. Klebl é um estudante de doutorado no programa de doutorado de 4 anos da Wellcome Trust no Centro Astbury financiado pela Universidade de Leeds. Os microscópios FEI Titan Krios foram financiados pela Universidade de Leeds (prêmio UoL ABSL) e Wellcome Trust (108466/Z/15/Z). Este trabalho foi financiado por uma subvenção do BBSRC para Stephen P. Muench (BB/P026397/1) e apoiado por bolsas de pesquisa para Howard D. White da American Heart Association (AMR21-236078) e Howard D. White e Vitold Galkin dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (171261).
Materials
| Time resolved device | |||
| acrylic glass box | USA scientific | ||
| digital humidity/temperature controller | THE20 digital humidity/temperature controller | ||
| dual rod pneumatic cylinder | dual rod pneumatic cylinder TN 10×70 | ||
| FEP tubing | Upchurch Scientific 1/16” O.D., 0.01'' I.D. FEP tubing | ||
| flangeless fittings | Upchurch Scientific ETFE/ETFE flangeless fittings | ||
| flexible reinforced PVC tubing | 12 mm OD. flexible reinforced PVC tubing | ||
| glass syringes | Kloehn 250 µL zero-dead volume | ||
| humidifier pump | Interpret Aqua Air AP3 | ||
| liquid ethane container | from Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV | ||
| multistage regulator | GASARC class 3 multistage regulator | ||
| negative pressure tweezers | Dumont N5 Inox B negative pressure tweezers | ||
| oscilloscope | Hantek 6022BE oscilloscope | ||
| PE tubing | Scientific Commodities Inc. 0.043” O.D., 0.015” I.D. PE tubing | ||
| power supply | Mean Well GSM160A24-R7B | ||
| power supply | Wanptek KPS305D power supply | ||
| PU tubing | SMC TU0425 4 mm O.D., 2.5 mm I.D. PU tubing | ||
| regulator | Norgren R72G-2GK-RMN | ||
| slide potentiometer | PS100 slide potentiometer | ||
| solenoid valve | SMC NVJ314M solenoid valve | ||
| syringe drive pumps | Kloehn V6 48K model | ||
| Reagents & Materials | |||
| apoferritin from equine spleen | Sigma-Aldrich, A3660 | ||
| ATP | Sigma-Aldrich, A2383 | ||
| cryo-EM grids | Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3 | ||
| EGTA | Sigma Aldrich E3889 | ||
| F-actin | Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 1) | ||
| glow-discharger | Cressington 208 carbon coater with a glow-discharge unit | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich, H7006 | ||
| KAc | Sigma-Aldrich, P1190 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, M8266 | ||
| MOPS | Sigma-Aldrich, M1254 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich, S9888 | ||
| Skeletal muscle myosin S1 | Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 2) | ||
| Ref 1 | Spudich, J. A. & Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of biological chemistry 246, 4866-4871 (1971). | ||
| Ref 2 | White, H. & Taylor, E. Energetics and mechanism of actomyosin adenosine triphosphatase. Bioquímica 15, 5818-5826 (1976). |
Referências
- Murphy, B. J., et al. Rotary substates of mitochondrial ATP synthase reveal the basis of flexible F1-Fo coupling. Science. 364, (2019).
- Benton, D. J., Gamblin, S. J., Rosenthal, P. B., Skehel, J. J. Structural transitions in influenza haemagglutinin at membrane fusion pH. Nature. , 1-4 (2020).
- Dance, A. Molecular motion on ice. Nature Methods. , 1-5 (2020).
- D’Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
- Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nature Methods. 15, 793-795 (2018).
- Klebl, D. P., et al. Need for speed: Examining protein behaviour during cryoEM grid preparation at different timescales. BioRxiv. , (2020).
- Ravelli, R. B., et al. Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification. Nature Communications. 11, 1-9 (2020).
- Arnold, S. A., et al. Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts. Journal of Structural Biology. 197, 220-226 (2017).
- Razinkov, I., et al. A new method for vitrifying samples for cryoEM. Journal of Structural Biology. 195, 190-198 (2016).
- Feng, X., et al. A fast and effective microfluidic spraying-plunging method for high-resolution single-particle cryo-EM. Structure. 25, 663-670 (2017).
- Ashtiani, D., et al. Delivery of femtolitre droplets using surface acoustic wave based atomisation for cryo-EM grid preparation. Journal of Structural Biology. 203, 94-101 (2018).
- Rubinstein, J. L., et al. Shake-it-off: a simple ultrasonic cryo-EM specimen-preparation device. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75, (2019).
- Mäeots, M. -. E., et al. Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM. Nature Communications. 11, 1-14 (2020).
- Kontziampasis, D., et al. A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies. IUCrJ. 6, (2019).
- Klebl, D. P., et al. Sample deposition onto cryo-EM grids: from sprays to jets and back. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 76, (2020).
- White, H., Thirumurugan, K., Walker, M., Trinick, J. A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray. Journal of Structural Biology. 144, 246-252 (2003).
- Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. . Protein Complex Assembly. , 59-71 (2018).
- Trebbin, M., et al. Microfluidic liquid jet system with compatibility for atmospheric and high-vacuum conditions. Lab on a Chip. 14, 1733-1745 (2014).
- Klebl, D. P., Sobott, F., White, H. D., Muench, S. P. On-grid and in-flow mixing for time-resolved Cryo-EM. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. , (2021).
- He, S., Scheres, S. H. Helical reconstruction in RELION. Journal of Structural Biology. 198, 163-176 (2017).
- Millar, N. C., Geeves, M. A. The limiting rate of the ATP-mediated dissociation of actin from rabbit skeletal muscle myosin subfragment 1. FEBS Letters. 160, 141-148 (1983).
- Kasas, S., Dumas, G., Dietler, G., Catsicas, S., Adrian, M. Vitrification of cryoelectron microscopy specimens revealed by high-speed photographic imaging. Journal of Microscopy. 211, 48-53 (2003).
- Glaeser, R. M., et al. Defocus-dependent Thon-ring fading. bioRxiv. , (2020).
- Bagshaw, C. A beginner’s guide to flow kinetics. The Biochemist. 42, (2020).
