Génération et expansion de cardiomyocytes humains à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique du patient
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour générer et développer de manière robuste des cardiomyocytes humains à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique du patient.
Abstract
La génération de cardiomyocytes spécifiques au patient à partir d’une seule prise de sang a suscité un énorme intérêt pour la médecine de précision sur les maladies cardiovasculaires. La différenciation cardiaque à partir des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPi) est modulée par des voies de signalisation définies qui sont essentielles au développement cardiaque embryonnaire. De nombreuses méthodes de différenciation cardiaque sur des plateformes 2D et 3D ont été développées avec diverses efficacités et rendements cardiomyocytaires. Cela a intrigué les chercheurs en dehors du terrain, car la variété de ces méthodes peut être difficile à suivre. Nous présentons ici un protocole complet qui élabore la génération et l’expansion robustes de cardiomyocytes spécifiques au patient à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC). Nous décrivons d’abord un protocole de reprogrammation iPSC à haute efficacité à partir de l’échantillon de sang d’un patient en utilisant des vecteurs du virus Sendai non intégrés. Nous détaillons ensuite une méthode de différenciation monocouche médiée par de petites molécules qui peut produire de manière robuste des cardiomyocytes battants à partir de la plupart des lignées iPSC humaines. En outre, un protocole évolutif d’expansion des cardiomyocytes est introduit à l’aide d’une petite molécule (CHIR99021) qui pourrait rapidement étendre les cardiomyocytes dérivés du patient pour des applications de qualité industrielle et clinique. À la fin, des protocoles détaillés pour l’identification moléculaire et la caractérisation électrophysiologique de ces iPSC-CM sont décrits. Nous nous attendons à ce que ce protocole soit pragmatique pour les débutants ayant des connaissances limitées sur le développement cardiovasculaire et la biologie des cellules souches.
Introduction
La découverte de cellules souches pluripotentes induites par l’homme a révolutionné la médecine cardiovasculaire moderne1,2. Les CSPi humaines sont capables de s’auto-renouveler et de générer tous les types de cellules dans le cœur, y compris les cardiomyocytes, les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses et les fibroblastes cardiaques. Les cardiomyocytes dérivés de l’iPSC des patients (iPSC-MC) peuvent servir de ressources indéfinies pour modéliser les maladies cardiovasculaires génétiquement héréditaires (MCV) et tester la sécurité cardiaque pour les nouveaux médicaments3. En particulier, les patients iPSC-CM sont bien placés pour étudier les étiologies génétiques et moléculaires des MCV dérivées de défauts dans les cardiomyocytes, tels que le syndrome du QT long4 et la cardiomyopathie dilatée (DCM)5. Combinés à l’édition du génome médiée par CRISPR / Cas9, les iPSC-CM des patients ont ouvert une voie sans précédent pour comprendre la base génétique complexe des MCV, y compris les malformations cardiaques congénitales (CHD)6,7,8. Les iPSC-CM humains ont également montré le potentiel de servir de sources cellulaires autologues pour reconstituer le myocarde endommagé lors d’une crise cardiaque9. Au cours des dernières années, il est devenu primordial de générer des iPSC-CM humains de haute qualité avec des sous-types définis (auriculaire, ventriculaire et nodal) pour la régénération cardiaque et les tests de médicaments10.
La différenciation cardiaque par rapport aux CSPi humaines a été très avancée au cours de la dernière décennie. Les méthodes de différenciation sont passées de la différenciation spontanée basée sur le corps embryoïde (EB) à la différenciation cardiaque chimiquement définie et dirigée11. Les molécules de signalisation clés essentielles au développement du cœur embryonnaire, telles que Wnt, BMP, Nodal et FGF, sont manipulées pour améliorer la différenciation des cardiomyocytes des CSPi humains10,12. Les progrès significatifs comprennent la modulation séquentielle de la signalisation Wnt (activation suivie d’inhibition) pour une génération robuste de cardiomyocytes à partir de CSPi humains13,14. Des recettes de différenciation cardiaque chimiquement définies ont été explorées pour faciliter la production à grande échelle de cardiomyocytesbattants 15,16, qui ont le potentiel d’être mis à niveau vers la production industrielle et clinique. De plus, l’expansion robuste des premiers iPSC-CM humains est obtenue par exposition à l’activation constitutive de Wnt à l’aide d’un petit produit chimique (CHIR99021)17. Plus récemment, les cardiomyocytes spécifiques au sous-type sont générés par manipulation des voies de signalisation de l’acide rétinoïque (PR) et de Wnt à des fenêtres de différenciation spécifiques lors de l’engagement de la lignée cardiomyocytaire des CSPi humaines18,19,20,21,22.
Dans ce protocole, nous détaillons une procédure de travail pour la génération et la prolifération robustes de MC humaines provenant de cellules mononucléaires du sang périphérique du patient. Nous présentons des protocoles pour 1) reprogrammer les PBMC humains en iPSC, 2) la génération robuste de cardiomyocytes battants à partir d’iPSC humains, 3) l’expansion rapide des iPSC-CM précoces, 4) la caractérisation moléculaire des iPSC-MC humains et 5) la mesure électrophysiologique des iPSC-CM humains au niveau d’une seule cellule par pince de patch. Ce protocole couvre les procédures expérimentales détaillées sur la conversion des cellules sanguines des patients en cardiomyocytes battants.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lors de la reprogrammation iPSC, il est essentiel de cultiver des PBMC pendant 1 semaine jusqu’à ce qu’ils soient élargis avec des noyaux clairs et du cytoplasme. Étant donné que les PBMC ne prolifèrent pas, un nombre de cellules approprié pour la transduction virale est important pour une reprogrammation réussie des CSPi. Le nombre de cellules des PBMC, la multiplicité de l’infection (MOI) et le titre du virus doivent être pris en compte et ajustés pour atteindre les résultats optimaux de transduction. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par le prix de développement de carrière 18CDA34110293 (M-T.Z.) de l’American Heart Association (AHA), les prix Additional Ventures AVIF et SVRF (M-T.Z.), les subventions 1R01HL124245, 1R01HL132520 et R01HL096962 (I.D.). Le Dr Ming-Tao Zhao a également été soutenu par des fonds de démarrage de l’Institut de recherche Abigail Wexner du Nationwide Children’s Hospital.
Materials
| ABI 7300 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | ||
| Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | Microelectrode Amplifier | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 supplement minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer |
| BD Vacutainer CPT tube | BD Biosciences | 362753 | Blood cell separation tube |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | Sendai virus reprogramming kit |
| Digidata 1200B | Axon Instruments | Acquisition board | |
| Direct-zol RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2050 | RNA extraction kit |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | |
| Essential 8 medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | E8 media for iPSC culture |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-glutamine alternative |
| Growth factor reduced Matrigel | Corning | 356231 | Basement membrane matrix |
| iScript cDNA Snythesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| IWR-1-endo | Selleck Chemicals | S7086 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| pCLAMP 7.0 | Molecular Devices | Electrophysiology data acquisition & analysis software | |
| Recombinant human EPO | Thermo Fisher Scientific | PHC9631 | |
| Recombinant human FLT3 | Thermo Fisher Scientific | PHC9414 | |
| Recombinant human IL3 | Peprotech | 200-03 | |
| Recombinant human IL6 | Thermo Fisher Scientific | PHC0065 | |
| Recombinant human SCF | Peprotech | 300-07 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| RPMI 1640 medium, no glucose | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | S36936 | Mounting media |
| StemPro-34 SFM | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | PBMC culture media |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444964 | qPCR master mix |
| TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | A1217703 | CM dissociation solution |
| UltraPure 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | iPSC dissociation solution |
| Y-27632 2HCl | Selleck Chemicals | S1049 |
Referências
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
- Hinson, J. T., et al. Titin mutations in iPS cells define sarcomere insufficiency as a cause of dilated cardiomyopathy. Science. 349 (6251), 982-986 (2015).
- Deacon, D. C., et al. Combinatorial interactions of genetic variants in human cardiomyopathy. Nature Biomedical Engineering. 3 (2), 147-157 (2019).
- Gifford, C. A., et al. Oligogenic inheritance of a human heart disease involving a genetic modifier. Science. 364 (6443), 865-870 (2019).
- Lo Sardo, V., et al. Unveiling the role of the most impactful cardiovascular risk locus through haplotype editing. Cell. 175 (7), 1796-1810 (2018).
- Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
- Zhao, M. T., Shao, N. Y., Garg, V. Subtype-specific cardiomyocytes for precision medicine: where are we now. Stem Cells. 38, 822-833 (2020).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Protze, S. I., Lee, J. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells: from developmental biology to therapeutic applications. Cell Stem Cell. 25 (3), 311-327 (2019).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
- Zhao, M. T., et al. Molecular and functional resemblance of differentiated cells derived from isogenic human iPSCs and SCNT-derived ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 11111-11120 (2017).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Lian, X., et al. Chemically defined, albumin-free human cardiomyocyte generation. Nature Methods. 12 (7), 595-596 (2015).
- Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human ipsc-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
- Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes develop from distinct mesoderm populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
- Liang, W., et al. Canonical Wnt signaling promotes pacemaker cell specification of cardiac mesodermal cells derived from mouse and human embryonic stem cells. Stem Cells. 38 (3), 352-368 (2020).
- Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
- Ren, J., et al. Canonical Wnt5b signaling directs outlying Nkx2.5+ mesoderm into pacemaker cardiomyocytes. Developmental Cell. 50 (6), 729-743 (2019).
- Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Research. 21 (4), 579-587 (2011).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Seriers B, Physical and Biological Sciences. 85 (8), 348-362 (2009).
- Stacey, G. N., Crook, J. M., Hei, D., Ludwig, T. Banking human induced pluripotent stem cells: lessons learned from embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (4), 385-388 (2013).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Zhao, L., Ben-Yair, R., Burns, C. E., Burns, C. G. Endocardial notch signaling promotes cardiomyocyte proliferation in the regenerating zebrafish heart through Wnt pathway antagonism. Cell Reports. 26 (3), 546-554 (2019).
- Heallen, T. R., Kadow, Z. A., Wang, J., Martin, J. F. Determinants of cardiac growth and size. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (3), 037150 (2020).
- Campa, V. M., et al. Notch activates cell cycle reentry and progression in quiescent cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 129-141 (2008).
- Collesi, C., Zentilin, L., Sinagra, G., Giacca, M. Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 117-128 (2008).
- Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).
