Beobachtung der Inselfunktion und der Wechselwirkungen zwischen Insel-Immunzellen in lebenden Pankreasgewebeschnitten
Summary
Diese Studie präsentiert die Anwendung von lebenden Pankreasgewebeschnitten auf die Untersuchung der Inselphysiologie und der Wechselwirkungen zwischen Insel-Immunzellen.
Abstract
Lebende Pankreasgewebeschnitte ermöglichen die Untersuchung der Physiologie und Funktion von Inseln im Kontext einer intakten Inselmikroumgebung. Die Scheiben werden aus lebendem Pankreasgewebe von Mensch und Maus hergestellt, das in Agarose eingebettet ist und mit einem Vibratom geschnitten wird. Diese Methode ermöglicht es dem Gewebe, die Lebensfähigkeit und Funktion aufrechtzuerhalten und die zugrunde liegenden Pathologien wie Typ-1-Diabetes (T1D) und Typ-2-Diabetes (T2D) zu erhalten. Die Slice-Methode ermöglicht neue Richtungen bei der Untersuchung der Bauchspeicheldrüse durch die Aufrechterhaltung der komplexen Strukturen und verschiedener interzellulärer Wechselwirkungen, die das endokrine und exokrine Gewebe der Bauchspeicheldrüse umfassen. Dieses Protokoll zeigt, wie man Färbung und Zeitraffermikroskopie von lebenden endogenen Immunzellen in Pankreasschnitten zusammen mit Bewertungen der Inselphysiologie durchführt. Darüber hinaus kann dieser Ansatz verfeinert werden, um Immunzellpopulationen zu erkennen, die für Inselzellantigene spezifisch sind, wobei wichtige Histokompatibilitäts-Komplex-Multimer-Reagenzien verwendet werden.
Introduction
Die Beteiligung der Bauchspeicheldrüse ist pathognomonisch bei Krankheiten wie Pankreatitis, T1D und T2D1,2,3. Die Untersuchung der Funktion in isolierten Inseln beinhaltet in der Regel die Entfernung der Inseln aus ihrer Umgebung4. Die Methode des lebenden Pankreasgewebeschnitts wurde entwickelt, um die Untersuchung von Pankreasgewebe unter Beibehaltung intakter Inselmikroumgebungen zu ermöglichen und die Verwendung von stressigen Inselisolationsverfahren zu vermeiden5,6,7. Pankreasgewebeschnitte aus menschlichem Spendergewebe wurden erfolgreich zur Untersuchung von T1D verwendet und haben Prozesse des Betazellverlustes und der Funktionsstörung zusätzlich zur Immunzellinfiltration gezeigt8,9,10,11,12,13. Die Methode des lebenden Pankreasgewebeschnitts kann sowohl auf Maus- als auch auf menschliches Pankreasgewebe angewendet werden5,6,8. Menschliche Pankreasgewebeschnitte aus Organspendergewebe werden durch eine Zusammenarbeit mit dem Netzwerk für Pankreasorganspender mit Diabetes (nPOD) gewonnen. Mausscheiben können aus einer Vielzahl verschiedener Mausstämme generiert werden.
Dieses Protokoll konzentriert sich auf nicht-fettleibige Diabetiker-Rekombination aktivierendes Gen-1-null (NOD. Rag1-/-) und T-Zell-Rezeptor transgen (AI4) (NOD. Rag1-/-. AI4 α/β) Mausstämme. NICKEN. Rag1-/- Mäuse können aufgrund einer Störung des rekombinationsaktivierenden Gens 1 (Rag1)14 keine T- und B-Zellen entwickeln. NICKEN. Rag1-/-. AI4 α/β Mäuse werden als Modell für beschleunigten Typ-1-Diabetes verwendet, da sie einen einzigen T-Zell-Klon produzieren, der auf ein Epitop von Insulin abzielt, was zu einer konsistenten Inselinfiltration und einer schnellen Krankheitsentwicklung führt15. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt Verfahren für funktionelle und immunologische Studien mit lebenden Pankreasschnitten von Mensch und Maus durch die Anwendung konfokaler Mikroskopieansätze. Die hierin beschriebenen Techniken umfassen Lebensfähigkeitsbewertungen, Identifizierung und Lokalisierung von Inselchen, zytosolische Ca2+ -Aufzeichnungen sowie Färbung und Identifizierung von Immunzellpopulationen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ziel dieses Protokolls ist es, die Erzeugung von Pankreasscheiben und die Verfahren, die für die Verwendung der Scheiben in funktionellen und immunologischen Studien erforderlich sind, zu erläutern. Es gibt viele Vorteile bei der Verwendung von lebenden Pankreasscheiben. Es gibt jedoch mehrere kritische Schritte, die wesentlich sind, damit das Gewebe während der beschriebenen Experimentprotokolle lebensfähig und nützlich bleibt. Es ist unerlässlich, schnell zu arbeiten. Die Zeitspanne zwischen der Injektion der Bau…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 und P01 AI042288 finanziert. Diese Forschung wurde mit Unterstützung des Netzwerks für Pankreasorganspender mit Diabetes (nPOD; RRID: SCR_014641), ein kollaboratives Typ-1-Diabetes-Forschungsprojekt, das von JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) und dem Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053) gesponsert wird. Der Inhalt und die geäußerten Ansichten liegen in der Verantwortung der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die offizielle Ansicht von nPOD wider. Organ Procurement Organizations (OPO), die mit nPOD zusammenarbeiten, um Forschungsressourcen bereitzustellen, sind unter http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/ aufgeführt. Vielen Dank an Dr. Kevin Otto, University of Florida, für die Bereitstellung des Vibratoms, das zur Erzeugung von Mausscheiben verwendet wird.
Materials
| #3 Style Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-163 | |
| 1 M HEPES | Fisher Scientific | BP299-100 | HEPES Buffer, 1M Solution |
| 10 cm Untreated Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 301029 | BD Syringe with Luer-Lok Tips |
| 27 G Needle | BD | BD 305109 | BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles |
| 35 mm coverglass-bottom Petri dish | Ibidi | 81156 | µ-Dish 35 mm, high |
| 50 mL syringe | BD | 309653 | |
| 8-well chambered coverglass | Ibidi | 80826 | µ-Slide 8 Well |
| APC anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100712 | |
| BSA | Fisher Scientific | 199898 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5670 | CaCl2 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | CaCl2 (dihydrate) |
| Compact Digital Rocker | Thermo Fisher Scientific | 88880020 | |
| Confocal laser-scanning microscope | Leica | SP8 | Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C6H12O6 |
| ddiH2O | |||
| Dithizone | Sigma-Aldrich | D5130-10G | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | Dimethyl sulfoxide |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2805 | |
| Falcon 35 mm tissue culture dish | Corning | 353001 | Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes |
| FBS | Gibco | 10082147 | |
| Feather No. 10 Surgical Blade | Electron Microscopy Sciences | 7204410 | |
| fluo-4-AM | Invitrogen | F14201 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Gel Control Super Glue | Loctite | 45198 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | Hanks Balanced Salt Solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | C8H18N2O4S |
| Ice bucket | Fisherbrand | 03-395-150 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-05 | |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz Surgical Store | RS-7440 | Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34705 | Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | This kit contains the calcein-AM live cell dye. |
| Low glucose DMEM | Corning | 10-014-CV | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | MgCl2 (hexahydrate) |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M2773 | MgSO4 (heptahydrate) |
| Magnetic Heated Platform | Warner Instruments | PM-1 | Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Microwave | GE | JES1460DSWW | |
| Nalgene Syringe Filter | Thermo Fisher Scientific | 726-2520 | |
| No.4 Paintbrush | Michaels | 10269140 | |
| Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | Imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Oregon Green 488 BAPTA-1-AM | Invitrogen | O6807 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Overnight imaging chamber | Okolab | H201-LG | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | To make agarose for slice generation |
| PE-labeled insulin tetramer | Emory Tetramer Research Core | sequence YAIENYLEL | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | KH2PO4 |
| Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 71998 | For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| SeaPlaque low melting-point agarose | Lonza | 50101 | To make agarose for slice generation |
| Slice anchor | Warner Instruments | 64-1421 | |
| Slice anchor (dynamic imaging) | Warner Instruments | 640253 | Slice anchor for dynamic imaging chamber |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | NaCl |
| Sodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | NaH2PO4 (monohydrate) |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20MW-AL | To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage |
| Stage-top incubator | Okolab | H201 | |
| Stereoscope | Leica | IC90 E MSV266 | |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain | Invitrogen | S34857 | blue-fluorescent nucleic acid stain |
| Transfer Pipet | Falcon | 357575 | Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets |
| Valve Control System | Warner Instruments | VCS-8 | System for dynamic stimulation recordings |
| Vibratome VT1000 S | Leica | VT1000 S | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 | Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02 |
Referências
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