Observeren van eilandjesfunctie en eiland-immuuncelinteracties in levende pancreasweefselplakken
Summary
Deze studie presenteert de toepassing van levende pancreasweefselplakken op de studie van eilandjesfysiologie en eiland-immuuncelinteracties.
Abstract
Levende pancreasweefselplakken maken de studie van eilandjesfysiologie en -functie mogelijk in de context van een intacte micro-omgeving van eilandjes. Plakjes worden bereid uit levend menselijk en muis pancreasweefsel ingebed in agarose en gesneden met behulp van een vibratome. Deze methode zorgt ervoor dat het weefsel levensvatbaarheid en functie behoudt, naast het behoud van onderliggende pathologieën zoals type 1 (T1D) en type 2 diabetes (T2D). De slice-methode maakt nieuwe richtingen mogelijk in de studie van de pancreas door het onderhoud van de complexe structuren en verschillende intercellulaire interacties die de endocriene en exocriene weefsels van de pancreas omvatten. Dit protocol demonstreert hoe kleuring en time-lapse microscopie van levende endogene immuuncellen in pancreasplakken kunnen worden uitgevoerd, samen met beoordelingen van de eilandjesfysiologie. Verder kan deze benadering worden verfijnd om immuuncelpopulaties te onderscheiden die specifiek zijn voor eilandcelantigenen met behulp van belangrijke histocompatibiliteit complex-multimeerreagentia.
Introduction
Betrokkenheid van de alvleesklier is pathognomonisch voor ziekten zoals pancreatitis, T1D en T2D1,2,3. De studie van de functie in geïsoleerde eilandjes omvat meestal het verwijderen van de eilandjes uit hun omgeving4. De methode voor het snijden van levend pancreasweefsel is ontwikkeld om de studie van pancreasweefsel mogelijk te maken met behoud van intacte micro-omgevingen van eilandjes en het vermijden van het gebruik van stressvolle isolatieprocedures voor eilandjes5,6,7. Pancreasweefselplakken van menselijk donorweefsel zijn met succes gebruikt om T1D te bestuderen en hebben processen van bètacelverlies en disfunctie aangetoond naast immuuncelinfiltratie8,9,10,11,12,13. De methode voor het snijden van levend pancreasweefsel kan worden toegepast op zowel muis- als menselijk pancreasweefsel5,6,8. Menselijke pancreasweefselplakken uit orgaandonorweefsels worden verkregen door een samenwerking met het Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD). Muissegmenten kunnen worden gegenereerd uit verschillende muizenstammen.
Dit protocol zal zich richten op niet-obese diabetische recombinatie activerende gen-1-null (NOD. Rag1-/-) en T-celreceptor transgeen (AI4) (NOD. Vod1-/-. AI4 α/β) muisstammen. KNIKKEN. Rag1-/- muizen zijn niet in staat om T- en B-cellen te ontwikkelen als gevolg van een verstoring in het recombinatie-activerende gen 1 (Rag1)14. KNIKKEN. Vod1-/-. AI4 α/β muizen worden gebruikt als model voor versnelde diabetes type 1 omdat ze een enkele T-celkloon produceren die zich richt op een epitoop van insuline, wat resulteert in consistente eilandjesinfiltratie en snelle ziekteontwikkeling15. Het protocol dat hier wordt getoond, beschrijft procedures voor functionele en immunologische studies met behulp van levende menselijke en muis pancreasplakken door de toepassing van confocale microscopiebenaderingen. De hierin beschreven technieken omvatten levensvatbaarheidsbeoordelingen, eilandjesidentificatie en -locatie, cytosolische Ca2 + -opnames, evenals kleuring en identificatie van immuuncelpopulaties.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het doel van dit protocol is om het genereren van pancreasplakken en de procedures die nodig zijn om de plakjes te gebruiken in functionele en immunologische studies te verklaren. Er zijn veel voordelen aan het gebruik van levende pancreasplakken. Er zijn echter verschillende kritieke stappen die essentieel zijn voor het weefsel om levensvatbaar en nuttig te blijven tijdens de beschreven experimentprotocollen. Het is noodzakelijk om snel te werken. De tijdsduur tussen het injecteren van de alvleesklier en het genereren v…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door NIH-subsidies R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 en P01 AI042288. Dit onderzoek is uitgevoerd met steun van het Netwerk voor Pancreas orgaandonoren met Diabetes (nPOD; RRID:SCR_014641), een gezamenlijk type 1 diabetes onderzoeksproject gesponsord door JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R), en The Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053). De inhoud en meningen die worden geuit, zijn de verantwoordelijkheid van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de officiële mening van nPOD. Organ Procurement Organizations (OPO) die samenwerken met nPOD om onderzoeksbronnen te bieden, worden vermeld op http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Dank aan Dr. Kevin Otto, Universiteit van Florida, voor het leveren van de vibratie die wordt gebruikt om muisplakken te genereren.
Materials
| #3 Style Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-163 | |
| 1 M HEPES | Fisher Scientific | BP299-100 | HEPES Buffer, 1M Solution |
| 10 cm Untreated Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 301029 | BD Syringe with Luer-Lok Tips |
| 27 G Needle | BD | BD 305109 | BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles |
| 35 mm coverglass-bottom Petri dish | Ibidi | 81156 | µ-Dish 35 mm, high |
| 50 mL syringe | BD | 309653 | |
| 8-well chambered coverglass | Ibidi | 80826 | µ-Slide 8 Well |
| APC anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100712 | |
| BSA | Fisher Scientific | 199898 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5670 | CaCl2 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | CaCl2 (dihydrate) |
| Compact Digital Rocker | Thermo Fisher Scientific | 88880020 | |
| Confocal laser-scanning microscope | Leica | SP8 | Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C6H12O6 |
| ddiH2O | |||
| Dithizone | Sigma-Aldrich | D5130-10G | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | Dimethyl sulfoxide |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2805 | |
| Falcon 35 mm tissue culture dish | Corning | 353001 | Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes |
| FBS | Gibco | 10082147 | |
| Feather No. 10 Surgical Blade | Electron Microscopy Sciences | 7204410 | |
| fluo-4-AM | Invitrogen | F14201 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Gel Control Super Glue | Loctite | 45198 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | Hanks Balanced Salt Solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | C8H18N2O4S |
| Ice bucket | Fisherbrand | 03-395-150 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-05 | |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz Surgical Store | RS-7440 | Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34705 | Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | This kit contains the calcein-AM live cell dye. |
| Low glucose DMEM | Corning | 10-014-CV | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | MgCl2 (hexahydrate) |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M2773 | MgSO4 (heptahydrate) |
| Magnetic Heated Platform | Warner Instruments | PM-1 | Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Microwave | GE | JES1460DSWW | |
| Nalgene Syringe Filter | Thermo Fisher Scientific | 726-2520 | |
| No.4 Paintbrush | Michaels | 10269140 | |
| Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | Imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Oregon Green 488 BAPTA-1-AM | Invitrogen | O6807 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Overnight imaging chamber | Okolab | H201-LG | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | To make agarose for slice generation |
| PE-labeled insulin tetramer | Emory Tetramer Research Core | sequence YAIENYLEL | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | KH2PO4 |
| Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 71998 | For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| SeaPlaque low melting-point agarose | Lonza | 50101 | To make agarose for slice generation |
| Slice anchor | Warner Instruments | 64-1421 | |
| Slice anchor (dynamic imaging) | Warner Instruments | 640253 | Slice anchor for dynamic imaging chamber |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | NaCl |
| Sodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | NaH2PO4 (monohydrate) |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20MW-AL | To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage |
| Stage-top incubator | Okolab | H201 | |
| Stereoscope | Leica | IC90 E MSV266 | |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain | Invitrogen | S34857 | blue-fluorescent nucleic acid stain |
| Transfer Pipet | Falcon | 357575 | Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets |
| Valve Control System | Warner Instruments | VCS-8 | System for dynamic stimulation recordings |
| Vibratome VT1000 S | Leica | VT1000 S | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 | Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02 |
Referências
- Uc, A., Fishman, D. S. Pancreatic disorders. Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).
- Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes. Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).
- Taylor, R. Type 2 diabetes: etiology and reversibility. Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).
- Meier, R. P., et al. Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases. Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).
- Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
- Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology. Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).
- Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Archive. 446 (5), 553-558 (2003).
- Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), 134525 (2020).
- Dolai, S., et al. Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis. Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).
- Dolai, S., et al. Pancreas-specific SNAP23 depletion prevents pancreatitis by attenuating pathological basolateral exocytosis and formation of trypsin-activating autolysosomes. Autophagy. , 1-14 (2020).
- Qadir, M. M. F., et al. Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration. Nature Communications. 11 (1), 3265 (2020).
- Cohrs, C. M., et al. Dysfunction of persisting β cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis. Cell Reports. 31 (1), 107469 (2020).
- Liang, T., et al. Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology. Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
- Lamont, D., et al. Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses. Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).
- Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. . Anesthesia and analgesia in laboratory animals. , (2011).
- Clark, S. A., Borland, K. M., Sherman, S. D., Rusack, T. C., Chick, W. L. Staining and in vitro toxicity of dithizone with canine, porcine, and bovine islets. Cell Transplantation. 3 (4), 299-306 (1994).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices. Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).
- Gál, E., et al. A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice. Frontiers in Physiology. 10, 938 (2019).
- Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PloS One. 8 (1), 54638 (2013).
- Stožer, A., et al. Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices. PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923 (2013).
- Früh, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization. Endocrinology. 162 (1), 136 (2021).
- Satin, L. S. New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion. Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).
- Ren, J., et al. Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).
- Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ. PLoS One. 8 (11), 78706 (2013).
- Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. Two-photon imaging of the immune system. Current Protocols in Cytometry. , (2012).
