लाइव अग्नाशय के ऊतक स्लाइस में आइलेट फ़ंक्शन और आइलेट-इम्यून सेल इंटरैक्शन का अवलोकन करना
Summary
यह अध्ययन आइलेट फिजियोलॉजी और आइलेट-प्रतिरक्षा सेल इंटरैक्शन के अध्ययन के लिए लाइव अग्नाशयी ऊतक स्लाइस के आवेदन को प्रस्तुत करता है।
Abstract
लाइव अग्नाशय के ऊतक स्लाइस आइलेट फिजियोलॉजी के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं और एक बरकरार आइलेट माइक्रोएन्वायरमेंट के संदर्भ में कार्य करते हैं। स्लाइस जीवित मानव और माउस अग्नाशय के ऊतकों से तैयार किए जाते हैं जो एगरोज में एम्बेडेड होते हैं और एक वाइब्रेटोम का उपयोग करके काटते हैं। यह विधि ऊतक को टाइप 1 (टी 1 डी) और टाइप 2 मधुमेह (टी 2 डी) जैसे अंतर्निहित विकृति को संरक्षित करने के अलावा व्यवहार्यता और कार्य को बनाए रखने की अनुमति देती है। स्लाइस विधि जटिल संरचनाओं और विभिन्न अंतरकोशिकीय इंटरैक्शन के रखरखाव के माध्यम से अग्न्याशय के अध्ययन में नई दिशाओं को सक्षम बनाती है जिसमें अग्न्याशय के अंतःस्रावी और एक्सोक्राइन ऊतक शामिल होते हैं। यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि आइलेट फिजियोलॉजी के आकलन के साथ अग्नाशय के स्लाइस के भीतर जीवित अंतर्जात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के धुंधला और समय-अंतराल माइक्रोस्कोपी कैसे किया जाए। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण को प्रमुख हिस्टोकॉम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स-मल्टीमर अभिकर्मकों का उपयोग करके आइलेट सेल एंटीजन के लिए विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिका आबादी को समझने के लिए परिष्कृत किया जा सकता है।
Introduction
अग्न्याशय की भागीदारी अग्नाशयशोथ, T1D, और T2D1, 2,3 जैसे रोगों के लिए pathognomonic है। पृथक आइलेट्स में फ़ंक्शन के अध्ययन में आमतौर पर उनके आसपास के वातावरण से आइलेट्स को हटाना शामिल होता है। जीवित अग्नाशय ऊतक स्लाइस विधि को अग्नाशय के ऊतकों के अध्ययन के लिए अनुमति देने के लिए विकसित किया गया था, जबकि बरकरार आइलेट माइक्रोएन्वायरमेंट को बनाए रखने और तनावपूर्ण आइलेट अलगाव प्रक्रियाओं के उपयोग से बचने के लिए 5,6,7। मानव दाता ऊतक से अग्नाशय के ऊतक स्लाइस का सफलतापूर्वक T1D का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है और प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ 8,9,10,11,12,13 के अलावा बीटा सेल हानि और शिथिलता की प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया गया है। लाइव अग्नाशय ऊतक स्लाइस विधि दोनों माउस और मानव अग्नाशय ऊतक 5,6,8 करने के लिए लागू किया जा सकता है। अंग दाता ऊतकों से मानव अग्नाशय के ऊतक स्लाइस मधुमेह (nPOD) के साथ अग्नाशय अंग दाताओं के लिए नेटवर्क के साथ एक सहयोग के माध्यम से प्राप्त कर रहे हैं। माउस स्लाइस विभिन्न माउस उपभेदों की एक किस्म से उत्पन्न किया जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल जीन-1-नल (NOD) को सक्रिय करने वाले गैर-मोटापे से ग्रस्त मधुमेह-पुनर्संयोजन पर ध्यान केंद्रित करेगा। Rag1-/-) और टी सेल रिसेप्टर ट्रांसजेनिक (AI4) (NOD) Rag1-/-. AI4 α/β) माउस उपभेदों. सिर हिलाना। Rag1-/- चूहे पुनर्संयोजन-सक्रिय जीन 1 (Rag1)14 में व्यवधान के कारण टी और बी कोशिकाओं को विकसित करने में असमर्थ हैं। सिर हिलाना। Rag1-/-. एआई 4 α / β चूहों का उपयोग त्वरित टाइप 1 मधुमेह के लिए एक मॉडल के रूप में किया जाता है क्योंकि वे एक एकल टी सेल क्लोन का उत्पादन करते हैं जो इंसुलिन के एक एपिटोप को लक्षित करता है, जिसके परिणामस्वरूप लगातार आइलेट घुसपैठ और तेजी से रोग विकास होता है। यहां चित्रित प्रोटोकॉल कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण के आवेदन के माध्यम से लाइव मानव और माउस अग्नाशय के स्लाइस का उपयोग करके कार्यात्मक और प्रतिरक्षाविज्ञानी अध्ययनों के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करता है। यहां वर्णित तकनीकों में व्यवहार्यता आकलन, आइलेट पहचान और स्थान, साइटोसोलिक Ca2 + रिकॉर्डिंग, साथ ही साथ प्रतिरक्षा कोशिका आबादी के धुंधला और पहचान शामिल हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य अग्न्याशय स्लाइस की पीढ़ी और कार्यात्मक और प्रतिरक्षाविज्ञानी अध्ययनों में स्लाइस को नियोजित करने के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं को स्पष्ट करना है। लाइव अग्नाशयी स्लाइस का उपय?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एनआईएच अनुदान R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638, और P01 AI042288 द्वारा वित्त पोषित किया गया था। यह शोध मधुमेह (nPOD) के साथ अग्नाशयी अंग दाताओं के लिए नेटवर्क के समर्थन के साथ किया गया था; RRID: SCR_014641), JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) द्वारा प्रायोजित एक सहयोगी टाइप 1 मधुमेह अनुसंधान परियोजना, और लियोना एम और हैरी बी हेल्मस्ले चैरिटेबल ट्रस्ट (ग्रांट #2018PG-T1D053)। व्यक्त की गई सामग्री और विचार लेखकों की जिम्मेदारी हैं और जरूरी नहीं कि एनपीओडी के आधिकारिक दृष्टिकोण को प्रतिबिंबित करें। अनुसंधान संसाधन प्रदान करने के लिए एनपीओडी के साथ साझेदारी करने वाले अंग खरीद संगठनों (ओपीओ) को http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/ पर सूचीबद्ध किया गया है। आप डॉ केविन Otto, फ्लोरिडा विश्वविद्यालय, माउस स्लाइस उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया vibratome प्रदान करने के लिए धन्यवाद.
Materials
| #3 Style Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-163 | |
| 1 M HEPES | Fisher Scientific | BP299-100 | HEPES Buffer, 1M Solution |
| 10 cm Untreated Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 301029 | BD Syringe with Luer-Lok Tips |
| 27 G Needle | BD | BD 305109 | BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles |
| 35 mm coverglass-bottom Petri dish | Ibidi | 81156 | µ-Dish 35 mm, high |
| 50 mL syringe | BD | 309653 | |
| 8-well chambered coverglass | Ibidi | 80826 | µ-Slide 8 Well |
| APC anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100712 | |
| BSA | Fisher Scientific | 199898 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5670 | CaCl2 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | CaCl2 (dihydrate) |
| Compact Digital Rocker | Thermo Fisher Scientific | 88880020 | |
| Confocal laser-scanning microscope | Leica | SP8 | Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C6H12O6 |
| ddiH2O | |||
| Dithizone | Sigma-Aldrich | D5130-10G | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | Dimethyl sulfoxide |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2805 | |
| Falcon 35 mm tissue culture dish | Corning | 353001 | Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes |
| FBS | Gibco | 10082147 | |
| Feather No. 10 Surgical Blade | Electron Microscopy Sciences | 7204410 | |
| fluo-4-AM | Invitrogen | F14201 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Gel Control Super Glue | Loctite | 45198 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | Hanks Balanced Salt Solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | C8H18N2O4S |
| Ice bucket | Fisherbrand | 03-395-150 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-05 | |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz Surgical Store | RS-7440 | Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34705 | Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | This kit contains the calcein-AM live cell dye. |
| Low glucose DMEM | Corning | 10-014-CV | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | MgCl2 (hexahydrate) |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M2773 | MgSO4 (heptahydrate) |
| Magnetic Heated Platform | Warner Instruments | PM-1 | Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Microwave | GE | JES1460DSWW | |
| Nalgene Syringe Filter | Thermo Fisher Scientific | 726-2520 | |
| No.4 Paintbrush | Michaels | 10269140 | |
| Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | Imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Oregon Green 488 BAPTA-1-AM | Invitrogen | O6807 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Overnight imaging chamber | Okolab | H201-LG | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | To make agarose for slice generation |
| PE-labeled insulin tetramer | Emory Tetramer Research Core | sequence YAIENYLEL | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | KH2PO4 |
| Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 71998 | For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| SeaPlaque low melting-point agarose | Lonza | 50101 | To make agarose for slice generation |
| Slice anchor | Warner Instruments | 64-1421 | |
| Slice anchor (dynamic imaging) | Warner Instruments | 640253 | Slice anchor for dynamic imaging chamber |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | NaCl |
| Sodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | NaH2PO4 (monohydrate) |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20MW-AL | To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage |
| Stage-top incubator | Okolab | H201 | |
| Stereoscope | Leica | IC90 E MSV266 | |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain | Invitrogen | S34857 | blue-fluorescent nucleic acid stain |
| Transfer Pipet | Falcon | 357575 | Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets |
| Valve Control System | Warner Instruments | VCS-8 | System for dynamic stimulation recordings |
| Vibratome VT1000 S | Leica | VT1000 S | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 | Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02 |
Referências
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