Observación de la función de los islotes y las interacciones entre los islotes y las células inmunes en rodajas de tejido pancreático vivo
Summary
Este estudio presenta la aplicación de rodajas de tejido pancreático vivo al estudio de la fisiología de los islotes y las interacciones entre los islotes y las células inmunes.
Abstract
Las rodajas de tejido pancreático vivo permiten el estudio de la fisiología y la función de los islotes en el contexto de un microambiente intacto de los islotes. Las rodajas se preparan a partir de tejido pancreático humano y de ratón vivo incrustado en agarosa y se cortan con un vibratomo. Este método permite que el tejido mantenga la viabilidad y la función, además de preservar patologías subyacentes como la diabetes tipo 1 (DT1) y la diabetes tipo 2 (DT2). El método de corte permite nuevas direcciones en el estudio del páncreas a través del mantenimiento de las estructuras complejas y diversas interacciones intercelulares que comprenden los tejidos endocrinos y exocrinos del páncreas. Este protocolo demuestra cómo realizar la tinción y la microscopía de lapso de tiempo de células inmunes endógenas vivas dentro de cortes pancreáticos junto con evaluaciones de la fisiología de los islotes. Además, este enfoque se puede refinar para discernir las poblaciones de células inmunes específicas para los antígenos de células de los islotes utilizando los principales reactivos complejos multimer de histocompatibilidad.
Introduction
La afectación del páncreas es patognomónica a enfermedades como la pancreatitis, la DT1 y la DT21,2,3. El estudio de la función en islotes aislados suele implicar la retirada de los islotes de su entornovológico4. El método de rebanada de tejido pancreático vivo se desarrolló para permitir el estudio del tejido pancreático manteniendo intactos los microambientes de los islotes y evitando el uso de procedimientos estresantes de aislamiento de islotes5,6,7. Las rodajas de tejido pancreático de tejido de donante humano se han utilizado con éxito para estudiar la DT1 y han demostrado procesos de pérdida y disfunción de células beta, además de la infiltración de células inmunes8,9,10,11,12,13. El método de rebanada de tejido pancreático vivo se puede aplicar tanto al tejido pancreático de ratón como al humano5,6,8. Las rebanadas de tejido pancreático humano de tejidos de donantes de órganos se obtienen a través de una colaboración con la Red de Donantes de Órganos Pancreáticos con Diabetes (nPOD). Las rodajas de ratón se pueden generar a partir de una variedad de diferentes cepas de ratón.
Este protocolo se centrará en la recombinación diabética no obesa activando el gen-1-null (NOD. Rag1-/-) y receptor de células T transgénico (AI4) (NOD. Rag1-/-. CEPAS de ratón AI4 α/β). CABECEO. Los ratones Rag1-/- son incapaces de desarrollar células T y B debido a una interrupción en el gen 1 (Rag1)14 activador de la recombinación. CABECEO. Rag1-/-. Los ratones AI4 α/β se utilizan como modelo para la diabetes tipo 1 acelerada porque producen un solo clon de células T que se dirige a un epítopo de insulina, lo que resulta en una infiltración constante de islotes y un rápido desarrollo de la enfermedad15. El protocolo presentado aquí describe procedimientos para estudios funcionales e inmunológicos utilizando cortes pancreáticos vivos humanos y de ratón a través de la aplicación de enfoques de microscopía confocal. Las técnicas descritas en este documento incluyen evaluaciones de viabilidad, identificación y localización de islotes, registros de Ca2+ citosólico, así como tinción e identificación de poblaciones de células inmunes.
Protocol
Representative Results
Discussion
El objetivo de este protocolo es explicar la generación de lonchas de páncreas y los procedimientos necesarios para emplear las rebanadas en estudios funcionales e inmunológicos. Hay muchos beneficios al usar rebanadas pancreáticas vivas. Sin embargo, hay varios pasos críticos que son esenciales para que el tejido siga siendo viable y útil durante los protocolos de experimento descritos. Es imperativo trabajar rápidamente. El tiempo transcurrido entre la inyección del páncreas y la generación de las rebanadas e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por las subvenciones de los NIH R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 y P01 AI042288. Esta investigación se realizó con el apoyo de la Red de Donantes de Órganos Pancreáticos con Diabetes (nPOD; RRID: SCR_014641), un proyecto colaborativo de investigación de la diabetes tipo 1 patrocinado por JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) y The Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053). El contenido y las opiniones expresadas son responsabilidad de los autores y no reflejan necesariamente la opinión oficial de nPOD. Las organizaciones de obtención de órganos (OPO) que se asocian con nPOD para proporcionar recursos de investigación se enumeran en http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Gracias al Dr. Kevin Otto, de la Universidad de Florida, por proporcionar el vibratomo utilizado para generar rodajas de ratón.
Materials
| #3 Style Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-163 | |
| 1 M HEPES | Fisher Scientific | BP299-100 | HEPES Buffer, 1M Solution |
| 10 cm Untreated Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 301029 | BD Syringe with Luer-Lok Tips |
| 27 G Needle | BD | BD 305109 | BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles |
| 35 mm coverglass-bottom Petri dish | Ibidi | 81156 | µ-Dish 35 mm, high |
| 50 mL syringe | BD | 309653 | |
| 8-well chambered coverglass | Ibidi | 80826 | µ-Slide 8 Well |
| APC anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100712 | |
| BSA | Fisher Scientific | 199898 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5670 | CaCl2 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | CaCl2 (dihydrate) |
| Compact Digital Rocker | Thermo Fisher Scientific | 88880020 | |
| Confocal laser-scanning microscope | Leica | SP8 | Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C6H12O6 |
| ddiH2O | |||
| Dithizone | Sigma-Aldrich | D5130-10G | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | Dimethyl sulfoxide |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2805 | |
| Falcon 35 mm tissue culture dish | Corning | 353001 | Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes |
| FBS | Gibco | 10082147 | |
| Feather No. 10 Surgical Blade | Electron Microscopy Sciences | 7204410 | |
| fluo-4-AM | Invitrogen | F14201 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Gel Control Super Glue | Loctite | 45198 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | Hanks Balanced Salt Solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | C8H18N2O4S |
| Ice bucket | Fisherbrand | 03-395-150 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-05 | |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz Surgical Store | RS-7440 | Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34705 | Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | This kit contains the calcein-AM live cell dye. |
| Low glucose DMEM | Corning | 10-014-CV | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | MgCl2 (hexahydrate) |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M2773 | MgSO4 (heptahydrate) |
| Magnetic Heated Platform | Warner Instruments | PM-1 | Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Microwave | GE | JES1460DSWW | |
| Nalgene Syringe Filter | Thermo Fisher Scientific | 726-2520 | |
| No.4 Paintbrush | Michaels | 10269140 | |
| Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | Imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Oregon Green 488 BAPTA-1-AM | Invitrogen | O6807 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Overnight imaging chamber | Okolab | H201-LG | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | To make agarose for slice generation |
| PE-labeled insulin tetramer | Emory Tetramer Research Core | sequence YAIENYLEL | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | KH2PO4 |
| Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 71998 | For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| SeaPlaque low melting-point agarose | Lonza | 50101 | To make agarose for slice generation |
| Slice anchor | Warner Instruments | 64-1421 | |
| Slice anchor (dynamic imaging) | Warner Instruments | 640253 | Slice anchor for dynamic imaging chamber |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | NaCl |
| Sodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | NaH2PO4 (monohydrate) |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20MW-AL | To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage |
| Stage-top incubator | Okolab | H201 | |
| Stereoscope | Leica | IC90 E MSV266 | |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain | Invitrogen | S34857 | blue-fluorescent nucleic acid stain |
| Transfer Pipet | Falcon | 357575 | Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets |
| Valve Control System | Warner Instruments | VCS-8 | System for dynamic stimulation recordings |
| Vibratome VT1000 S | Leica | VT1000 S | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 | Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02 |
Referências
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