Observera holmefunktion och interaktioner med holme-immunceller i levande bukspottskörtelvävnadsskivor
Summary
Denna studie presenterar tillämpningen av levande bukspottskörteln vävnad skivor till studien av holme fysiologi och holme-immun cell interaktioner.
Abstract
Levande bukspottskörteln vävnad skivor möjliggör studier av holme fysiologi och funktion i samband med en intakt holme mikromiljö. Skivor framställs av levande mänsklig och mus bukspottskörtelvävnad inbäddad i agaros och skärs med en vibratom. Denna metod gör det möjligt för vävnaden att upprätthålla livskraft och funktion förutom att bevara underliggande patologier som typ 1 (T1D) och typ 2-diabetes (T2D). Segmentmetoden möjliggör nya riktningar i studien av bukspottkörteln genom underhåll av de komplexa strukturerna och olika intercellulära interaktioner som utgör bukspottkörtelns endokrina och exokrinvävnader. Detta protokoll visar hur man utför färgning och tidsfördröjning mikroskopi av levande endogena immunceller inom bukspottskörteln skivor tillsammans med bedömningar av holme fysiologi. Vidare kan detta tillvägagångssätt förfinas för att urskilja immuncellpopulationer som är specifika för holmecellantigener med hjälp av större histokompatibilitet komplexa-multimer reagenser.
Introduction
Inblandning av bukspottkörteln är patognomonisk till sjukdomar som pankreatit, T1D och T2D1,2,3. Studien av funktion i isolerade holmar innebär vanligtvis avlägsnande av holmar från deras omgivande miljö4. Metoden levande bukspottskörteln vävnad skiva utvecklades för att möjliggöra studier av bukspottskörteln vävnad samtidigt upprätthålla intakta holme mikromiljö och undvika användning av stressiga holme isolering förfaranden5,6,7. Bukspottskörteln vävnad skivor från mänskliga givaren vävnad har framgångsrikt använts för att studera T1D och har visat processer av beta cell förlust och dysfunktion utöver immun cell infiltration8,9,10,11,12,13. Metoden levande bukspottskörtelvävnad kan tillämpas på både mus och mänsklig bukspottskörtelvävnad5,6,8. Mänskliga bukspottskörteln vävnad skivor från organdonator vävnader erhålls genom ett samarbete med Nätverket för bukspottskörteln organdonatorer med diabetes (nPOD). Mussegment kan genereras från en mängd olika musstammar.
Detta protokoll kommer att fokusera på icke-överviktiga diabetiker-rekombination aktivera gen-1-null (NOD. Rag1-/-) och T-cellsreceptortransgen (AI4) (NOD. Rag1-/-. AI4 α/β) musstammar. NICKA. Rag1-/- möss kan inte utveckla T- och B-celler på grund av en störning i den rekombinationsaktiverande genen 1 (Rag1)14. NICKA. Rag1-/-. AI4 α/β möss används som modell för accelererad typ 1-diabetes eftersom de producerar en enda T-cellsklon som riktar sig mot en epitop insulin, vilket resulterar i konsekvent holmeinfiltration och snabb sjukdomsutveckling15. Protokollet som presenteras här beskriver förfaranden för funktionella och immunologiska studier med levande mänskliga och mus bukspottskörteln skivor genom tillämpning av confocal mikroskopi metoder. De tekniker som beskrivs häri inkluderar lönsamhetsbedömningar, holmeidentifiering och plats, cytosoliska Ca2 + inspelningar, samt färgning och identifiering av immuncellpopulationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Syftet med detta protokoll är att explicate generering av bukspottkörtelskivor och de förfaranden som behövs för att använda skivorna i funktionella och immunologiska studier. Det finns många fördelar med att använda levande bukspottskörteln skivor. Det finns dock flera kritiska steg som är nödvändiga för att vävnaden ska förbli livskraftig och användbar under de beskrivna experimentprotokollen. Det är absolut nödvändigt att arbeta snabbt. Tiden mellan injicering av bukspottkörteln och generering av …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av NIH-bidrag R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 och P01 AI042288. Denna forskning utfördes med stöd av Nätverket för pankreasorgandonatorer med diabetes (nPOD; RRID:SCR_014641), ett samarbetsprojekt för typ 1-diabetes sponsrat av JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) och Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053). Innehållet och åsikterna som uttrycks är författarnas ansvar och återspeglar inte nödvändigtvis nPOD:s officiella uppfattning. Orgelanskaffningsorganisationer (OPO) som samarbetar med nPOD för att tillhandahålla forskningsresurser listas på http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Tack till Dr. Kevin Otto, University of Florida, för att du tillhandahåller vibratomen som används för att generera musskivor.
Materials
| #3 Style Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-163 | |
| 1 M HEPES | Fisher Scientific | BP299-100 | HEPES Buffer, 1M Solution |
| 10 cm Untreated Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 301029 | BD Syringe with Luer-Lok Tips |
| 27 G Needle | BD | BD 305109 | BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles |
| 35 mm coverglass-bottom Petri dish | Ibidi | 81156 | µ-Dish 35 mm, high |
| 50 mL syringe | BD | 309653 | |
| 8-well chambered coverglass | Ibidi | 80826 | µ-Slide 8 Well |
| APC anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100712 | |
| BSA | Fisher Scientific | 199898 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5670 | CaCl2 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | CaCl2 (dihydrate) |
| Compact Digital Rocker | Thermo Fisher Scientific | 88880020 | |
| Confocal laser-scanning microscope | Leica | SP8 | Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C6H12O6 |
| ddiH2O | |||
| Dithizone | Sigma-Aldrich | D5130-10G | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | Dimethyl sulfoxide |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2805 | |
| Falcon 35 mm tissue culture dish | Corning | 353001 | Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes |
| FBS | Gibco | 10082147 | |
| Feather No. 10 Surgical Blade | Electron Microscopy Sciences | 7204410 | |
| fluo-4-AM | Invitrogen | F14201 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Gel Control Super Glue | Loctite | 45198 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | Hanks Balanced Salt Solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | C8H18N2O4S |
| Ice bucket | Fisherbrand | 03-395-150 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-05 | |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz Surgical Store | RS-7440 | Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34705 | Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | This kit contains the calcein-AM live cell dye. |
| Low glucose DMEM | Corning | 10-014-CV | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | MgCl2 (hexahydrate) |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M2773 | MgSO4 (heptahydrate) |
| Magnetic Heated Platform | Warner Instruments | PM-1 | Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Microwave | GE | JES1460DSWW | |
| Nalgene Syringe Filter | Thermo Fisher Scientific | 726-2520 | |
| No.4 Paintbrush | Michaels | 10269140 | |
| Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | Imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Oregon Green 488 BAPTA-1-AM | Invitrogen | O6807 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Overnight imaging chamber | Okolab | H201-LG | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | To make agarose for slice generation |
| PE-labeled insulin tetramer | Emory Tetramer Research Core | sequence YAIENYLEL | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | KH2PO4 |
| Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 71998 | For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| SeaPlaque low melting-point agarose | Lonza | 50101 | To make agarose for slice generation |
| Slice anchor | Warner Instruments | 64-1421 | |
| Slice anchor (dynamic imaging) | Warner Instruments | 640253 | Slice anchor for dynamic imaging chamber |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | NaCl |
| Sodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | NaH2PO4 (monohydrate) |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20MW-AL | To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage |
| Stage-top incubator | Okolab | H201 | |
| Stereoscope | Leica | IC90 E MSV266 | |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain | Invitrogen | S34857 | blue-fluorescent nucleic acid stain |
| Transfer Pipet | Falcon | 357575 | Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets |
| Valve Control System | Warner Instruments | VCS-8 | System for dynamic stimulation recordings |
| Vibratome VT1000 S | Leica | VT1000 S | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 | Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02 |
Referências
- Uc, A., Fishman, D. S. Pancreatic disorders. Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).
- Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes. Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).
- Taylor, R. Type 2 diabetes: etiology and reversibility. Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).
- Meier, R. P., et al. Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases. Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).
- Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
- Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology. Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).
- Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Archive. 446 (5), 553-558 (2003).
- Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), 134525 (2020).
- Dolai, S., et al. Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis. Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).
- Dolai, S., et al. Pancreas-specific SNAP23 depletion prevents pancreatitis by attenuating pathological basolateral exocytosis and formation of trypsin-activating autolysosomes. Autophagy. , 1-14 (2020).
- Qadir, M. M. F., et al. Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration. Nature Communications. 11 (1), 3265 (2020).
- Cohrs, C. M., et al. Dysfunction of persisting β cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis. Cell Reports. 31 (1), 107469 (2020).
- Liang, T., et al. Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology. Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
- Lamont, D., et al. Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses. Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).
- Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. . Anesthesia and analgesia in laboratory animals. , (2011).
- Clark, S. A., Borland, K. M., Sherman, S. D., Rusack, T. C., Chick, W. L. Staining and in vitro toxicity of dithizone with canine, porcine, and bovine islets. Cell Transplantation. 3 (4), 299-306 (1994).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices. Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).
- Gál, E., et al. A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice. Frontiers in Physiology. 10, 938 (2019).
- Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PloS One. 8 (1), 54638 (2013).
- Stožer, A., et al. Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices. PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923 (2013).
- Früh, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization. Endocrinology. 162 (1), 136 (2021).
- Satin, L. S. New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion. Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).
- Ren, J., et al. Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).
- Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ. PLoS One. 8 (11), 78706 (2013).
- Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. Two-photon imaging of the immune system. Current Protocols in Cytometry. , (2012).
