Canlı Pankreas Doku Dilimlerinde Adacık fonksiyonu ve Adacık-İmmün Hücre Etkileşimlerinin Gözlemlenmesi
Summary
Bu çalışma, canlı pankreas doku dilimlerinin adacık fizyolojisi ve adacık-immün hücre etkileşimlerinin incelenmesine uygulanmasını sunun.
Abstract
Canlı pankreas doku dilimleri, adacık fizyolojisinin incelenmesine ve bozulmamış bir adacık mikroçevresi bağlamında işleve izin verir. Dilimler agarose içine gömülü canlı insan ve fare pankreas dokusundan hazırlanır ve vibratom kullanılarak kesilir. Bu yöntem, dokunun tip 1 (T1D) ve tip 2 diyabet (T2D) gibi altta kalan patolojileri korumanın yanı sıra canlılığını ve işlevini korumasını sağlar. Dilim yöntemi, pankreasın endokrin ve ekzokrin dokularını oluşturan karmaşık yapıların ve çeşitli hücreler arası etkileşimlerin sürdürülmesi yoluyla pankreasın incelenmesinde yeni yönler sağlar. Bu protokol, adacık fizyolojisi değerlendirmeleri ile birlikte pankreas dilimleri içindeki canlı endojen bağışıklık hücrelerinin lekeleme ve zaman atlamalı mikroskopisinin nasıl gerçekleştirildiğini göstermektedir. Ayrıca, bu yaklaşım, ana histocompatibility complex-multimer reaktifler kullanılarak adacık hücresi antijenlerine özgü immün hücre popülasyonlarını ayırt etmek için rafine edilebilir.
Introduction
Pankreasın tutulumu pankreatit, T1D ve T2D1,2,3 gibi hastalıklara patognomoniktir. İzole adacıklardaki fonksiyon çalışması genellikle adacıkların çevrelerinden uzaklaştırılmasını içerir4. Canlı pankreas dokusu dilim yöntemi, sağlam adacık mikroçevrelerini korurken ve stresli adacık izolasyon prosedürlerinin kullanımından kaçınırken pankreas dokusunun incelenmesine olanak sağlamak için geliştirilmiştir5,6,7. İnsan donör dokusundan alınan pankreas dokusu dilimleri T1D’yi incelemek için başarıyla kullanılmış ve immün hücre infiltrasyonunun yanı sıra beta hücre kaybı ve işlev bozukluğu süreçlerini göstermiştir8,9,10,11,12,13. Canlı pankreas dokusu dilimleme yöntemi hem fare hem de insan pankreas dokusuna uygulanabilir5,6,8. Organ donör dokularından insan pankreas dokusu dilimleri, Diyabetli Pankreas Organ Bağışçıları Ağı (nPOD) ile işbirliği ile elde edilir. Fare dilimleri çeşitli farklı fare suşlarından oluşturulabilir.
Bu protokol, gen-1-null ‘ı (NOD) aktive eden obez olmayan diyabetik-rekombinasyona odaklanacaktır. Rag1-/-) ve T hücre reseptör transgenik (AI4) (NOD. Rag1-/-. AI4 α/β) fare suşları. NOD. Rag1-/- fareler, rekombinasyon aktive edici gen 1 (Rag1)14’teki bir bozulma nedeniyle T ve B hücreleri geliştiremezler. NOD. Rag1-/-. AI4 α/β fareleri hızlandırılmış tip 1 diyabet için bir model olarak kullanılır, çünkü insülin epitopunu hedefleyen tek bir T hücre klonu üretirler, bu da tutarlı adacık infiltişi ve hızlı hastalık gelişimi ile sonuçlanır15. Burada yer alan protokolde konfokal mikroskopi yaklaşımlarının uygulanması yoluyla canlı insan ve fare pankreas dilimleri kullanılarak fonksiyonel ve immünolojik çalışmalara yönelik prosedürler açıklanmaktadır. Burada açıklanan teknikler arasında canlılık değerlendirmeleri, adacık tanımlama ve konum, sitozolitik Ca2+ kayıtlarının yanı sıra bağışıklık hücresi popülasyonlarının lekelenerek tanımlanması yer almaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolün amacı, pankreas dilimlerinin neslini ve dilimleri fonksiyonel ve immünolojik çalışmalarda çalıştırmak için gereken prosedürleri ortadan çıkarmaktır. Canlı pankreas dilimleri kullanmanın birçok faydası vardır. Bununla birlikte, açıklanan deney protokolleri sırasında dokunun canlı ve yararlı kalması için gerekli olan birkaç kritik adım vardır. Hızlı çalışmak zorunludur. Doku canlılığını korumak için pankreasın enjekte edilmesi ile vibratom üzerindeki dilimlerin üre…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH hibe R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 ve P01 AI042288 hibeleri tarafından finanse edildi. Bu araştırma Diyabetli Pankreas Organ bağışçıları Ağı (nPOD; RRID:SCR_014641), JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) ve Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053) sponsorluğunda ortak tip 1 diyabet araştırma projesidir. İfade edilen içerik ve görüşler yazarların sorumluluğundadır ve nPOD’un resmi görünümünü yansıtmak zorunda değildir. Araştırma kaynakları sağlamak için nPOD ile ortaklık sağlayan Organ Tedarik Kuruluşları (OPO) http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/’de listelenmiştir. Florida Üniversitesi’nden Dr. Kevin Otto’ya fare dilimleri üretmek için kullanılan vibratomu sağladığınız için teşekkür ederiz.
Materials
| #3 Style Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-163 | |
| 1 M HEPES | Fisher Scientific | BP299-100 | HEPES Buffer, 1M Solution |
| 10 cm Untreated Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 301029 | BD Syringe with Luer-Lok Tips |
| 27 G Needle | BD | BD 305109 | BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles |
| 35 mm coverglass-bottom Petri dish | Ibidi | 81156 | µ-Dish 35 mm, high |
| 50 mL syringe | BD | 309653 | |
| 8-well chambered coverglass | Ibidi | 80826 | µ-Slide 8 Well |
| APC anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100712 | |
| BSA | Fisher Scientific | 199898 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5670 | CaCl2 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | CaCl2 (dihydrate) |
| Compact Digital Rocker | Thermo Fisher Scientific | 88880020 | |
| Confocal laser-scanning microscope | Leica | SP8 | Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C6H12O6 |
| ddiH2O | |||
| Dithizone | Sigma-Aldrich | D5130-10G | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | Dimethyl sulfoxide |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2805 | |
| Falcon 35 mm tissue culture dish | Corning | 353001 | Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes |
| FBS | Gibco | 10082147 | |
| Feather No. 10 Surgical Blade | Electron Microscopy Sciences | 7204410 | |
| fluo-4-AM | Invitrogen | F14201 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Gel Control Super Glue | Loctite | 45198 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | Hanks Balanced Salt Solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | C8H18N2O4S |
| Ice bucket | Fisherbrand | 03-395-150 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-05 | |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz Surgical Store | RS-7440 | Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34705 | Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | This kit contains the calcein-AM live cell dye. |
| Low glucose DMEM | Corning | 10-014-CV | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | MgCl2 (hexahydrate) |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M2773 | MgSO4 (heptahydrate) |
| Magnetic Heated Platform | Warner Instruments | PM-1 | Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Microwave | GE | JES1460DSWW | |
| Nalgene Syringe Filter | Thermo Fisher Scientific | 726-2520 | |
| No.4 Paintbrush | Michaels | 10269140 | |
| Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | Imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Oregon Green 488 BAPTA-1-AM | Invitrogen | O6807 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Overnight imaging chamber | Okolab | H201-LG | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | To make agarose for slice generation |
| PE-labeled insulin tetramer | Emory Tetramer Research Core | sequence YAIENYLEL | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | KH2PO4 |
| Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 71998 | For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| SeaPlaque low melting-point agarose | Lonza | 50101 | To make agarose for slice generation |
| Slice anchor | Warner Instruments | 64-1421 | |
| Slice anchor (dynamic imaging) | Warner Instruments | 640253 | Slice anchor for dynamic imaging chamber |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | NaCl |
| Sodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | NaH2PO4 (monohydrate) |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20MW-AL | To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage |
| Stage-top incubator | Okolab | H201 | |
| Stereoscope | Leica | IC90 E MSV266 | |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain | Invitrogen | S34857 | blue-fluorescent nucleic acid stain |
| Transfer Pipet | Falcon | 357575 | Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets |
| Valve Control System | Warner Instruments | VCS-8 | System for dynamic stimulation recordings |
| Vibratome VT1000 S | Leica | VT1000 S | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 | Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02 |
Referências
- Uc, A., Fishman, D. S. Pancreatic disorders. Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).
- Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes. Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).
- Taylor, R. Type 2 diabetes: etiology and reversibility. Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).
- Meier, R. P., et al. Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases. Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).
- Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
- Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology. Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).
- Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Archive. 446 (5), 553-558 (2003).
- Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), 134525 (2020).
- Dolai, S., et al. Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis. Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).
- Dolai, S., et al. Pancreas-specific SNAP23 depletion prevents pancreatitis by attenuating pathological basolateral exocytosis and formation of trypsin-activating autolysosomes. Autophagy. , 1-14 (2020).
- Qadir, M. M. F., et al. Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration. Nature Communications. 11 (1), 3265 (2020).
- Cohrs, C. M., et al. Dysfunction of persisting β cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis. Cell Reports. 31 (1), 107469 (2020).
- Liang, T., et al. Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology. Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
- Lamont, D., et al. Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses. Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).
- Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. . Anesthesia and analgesia in laboratory animals. , (2011).
- Clark, S. A., Borland, K. M., Sherman, S. D., Rusack, T. C., Chick, W. L. Staining and in vitro toxicity of dithizone with canine, porcine, and bovine islets. Cell Transplantation. 3 (4), 299-306 (1994).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices. Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).
- Gál, E., et al. A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice. Frontiers in Physiology. 10, 938 (2019).
- Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PloS One. 8 (1), 54638 (2013).
- Stožer, A., et al. Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices. PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923 (2013).
- Früh, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization. Endocrinology. 162 (1), 136 (2021).
- Satin, L. S. New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion. Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).
- Ren, J., et al. Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).
- Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ. PLoS One. 8 (11), 78706 (2013).
- Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. Two-photon imaging of the immune system. Current Protocols in Cytometry. , (2012).
