Isolering och kultur av bosatta hjärtmakrofager från murin sinoatriell och atrioventrikulär nod
Summary
Protokollet som presenteras här ger en steg-för-steg-metod för isolering av hjärtboende makrofager från sinoatriell nod (SAN) och atrioventrikulär nod (AVN) region av mushjärtan.
Abstract
Bosatta hjärtmakrofager har visat sig underlätta den elektriska ledningen i hjärtat. Den fysiologiska hjärtrytmen initieras av elektriska impulser som genereras i sinoatriell nod (SAN) och leds sedan till ventriklar via atrioventrikulär nod (AVN). För att ytterligare studera rollen som bosatta makrofager i hjärtledningssystemet är en korrekt isolering av bosatta makrofager från SAN och AVN nödvändig, men det är fortfarande utmanande. Här tillhandahåller vi ett protokoll för tillförlitlig mikrodissektion av SAN och AVN i murina hjärtan följt av isolering och kultur av bosatta makrofager.
Båda, SAN som ligger vid korsningen av crista terminalis med den överlägsna vena cava, och AVN som ligger vid toppen av triangeln i Koch, identifieras och mikrodissekeras. Korrekt placering bekräftas genom histologisk analys av vävnaden utförd med Massons trikromfläck och av anti-HCN4.
Mikrodissekerade vävnader smälts sedan enzymatiskt för att erhålla encellssuspensioner följt av inkubation med en specifik panel av antikroppar riktade mot celltypspecifika ytmarkörer. Detta gör det möjligt att identifiera, räkna eller isolera olika cellpopulationer genom fluorescerande aktiverad cellsortering. För att skilja hjärtboende makrofager från andra immunceller i myokardiet, särskilt rekryterade monocyt-härledda makrofager, behövs en delikat utformad gatingstrategi. Först detekteras lymfoida härstamningsceller och utesluts från vidare analys. Därefter identifieras myeloida celler med bosatta makrofager som bestäms av högt uttryck av både CD45 och CD11b och lågt uttryck av Ly6C. Med cellsortering kan isolerade hjärtmakrofager sedan odlas in vitro under flera dagar för vidare undersökning. Vi beskriver därför ett protokoll för att isolera hjärtboende makrofager som finns i hjärtledningssystemet. Vi diskuterar fallgropar vid mikrodissekering och smältning av SAN och AVN, och tillhandahåller en grindstrategi för att på ett tillförlitligt sätt identifiera, räkna och sortera hjärtmakrofager genom fluorescensaktiverad cellsortering.
Introduction
Den sinoatriella noden (SAN) initierar fysiologiskt den elektriska impulsen och är därför hjärtats primära pacemaker. Den atrioventrikulära noden (AVN) leder den elektriska impulsen från förmaken till ventriklarna och fungerar också som en underordnad pacemaker1. I allmänhet är generering och ledning av elektriska impulser en komplex process som kan moduleras av olika faktorer2, inklusive bosatt makrofag i SAN / AVN-regioner. visar en specifik population av hjärtboende makrofager som är berikade i AVN och fungerar som nyckelspelare för att hålla en stadig hjärtslag3. De fann att makrofager är elektriskt kopplade till kardiomyocyterna och kan förändra de elektriska egenskaperna hos kopplade kardiomyocyter. Författarna noterar också att sådana ledande celler som interfolierar med makrofager också finns i andra komponenter i hjärtledningssystemet, såsom SAN.
För närvarande är det inte helt känt om fenotypen hos bosatta hjärtmakrofager skiljer sig mellan hjärtregionerna. Det har emellertid visats att vävnadsmikromiljön kan påverka transkription och proliferativ förnyelse av vävnadsmakrofager4. Eftersom kardiomyocytfenotypen har visat sig vara olika mellan regioner kan makrofagernas funktionella effekter på kardiomyocyter också vara regionspecifika, även om makrofagfenotypen i sig kan vara densamma. Därför behövs ytterligare studier om specifika hjärtregioner.
Nya studier har visat att vid steady state etableras de vävnadsboende makrofagerna prenatalt, uppstår oberoende av definitiv hematopoiesis och kvarstår i vuxen ålder5. Men efter makrofagutarmning eller under hjärtinflammation bidrar Ly6chi-monocyter till att fylla på hjärtmakrofagpopulationen6. Studier som involverade genetisk härstamningsspårning, parabios, ödekartläggning och cellspårning visade samexistensen av en mängd olika vävnadsboende makrofagpopulationer i organ och vävnader, och även olika cellulära beteenden hos makrofagundergrupper som potentiellt är associerade med deras ontogeni 7,8,9.
Karakterisering av bosatta hjärtmakrofager har gynnats av användningen av magnetisk aktiverad cellsortering (MACS) och fluorescerande aktiverad cellsortering. Dessa metoder är särskilt användbara för att isolera specifika cellpopulationer från flera vävnadsfraktioner genom att märka dem med sina cellytmarkörer. Detta leder inte bara till en högre renhet av den isolerade immuncelltypen, utan möjliggör också fenotypisk analys. Här presenterar vi ett protokoll inklusive magnetiska pärlor-belagda celler följt av fluorescerande aktiverad cellsortering för anrikning av hjärtboende makrofager specifikt isolerade från SAN- och AVN-regionen.
För att utforska egenskaperna hos hjärtboende makrofager i ledningssystemet och deras funktion för hjärtledning och arytmogenes är exakt lokalisering och dissektion av SAN och AVN avgörande. För mikrodissektion av SAN och AVN används anatomiska landmärken för regionidentifiering10. I korthet ligger SAN vid korsningen av den överlägsna vena cava och högra atriumet. AVN ligger inom triangeln i Koch, som är främre gränsad av tricuspidventilens septalbroschyr och bakre av senan i Todaro11. Vi tillhandahåller också en exakt mikrodissektionsprocedur av SAN och AVN hos möss som bekräftas av histologi och immunofluorescensfärgning.
Isolerade bosatta makrofager kan användas för ytterligare experiment som RNA-sekvensering eller kan återvinnas och odlas i mer än två veckor vilket möjliggör olika in vitro-experiment. Därför beskriver vårt protokoll ett mycket värdefullt förfarande för immunrytmologen. Tabell 1 visar sammansättningen av alla lösningar som behövs, figur 1 visar mikrodissektionsmärkena för SAN och AVN. Figur 2 är schematisk illustration av SAN- och AVN-lokalisering. Figur 3 visar den histologiska färgningen av SAN och AVN (Massons trikrom- och immunofluorescensfärgning). Figur 4 visar en steg-för-steg-grindstrategi för att isolera hjärtboende makrofager genom fluorescensaktiverad cellsortering.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta manuskript beskriver vi ett protokoll för anrikning av hjärtboende makrofager specifikt från SAN- och AVN-regionerna vid hög renhet.
Makrofager är indelade i delpopulationer baserat på deras anatomiska läge och funktionella fenotyp. De kan också växla från en funktionell fenotyp till en annan som svar på variabla mikromiljösignaler13. Jämfört med andra organ som benmärg och lever innehåller hjärtvävnad en lägre andel immunceller och lägre abs…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av China Scholarship Council (CSC, till R. Xia), det tyska centret för kardiovaskulär forskning (DZHK; 81X2600255 till S. Clauss, 81Z0600206 till S. Kääb, 81Z0600204 till CS), Corona Foundation (S199/10079/2019 till S. Clauss), SFB 914 (projekt Z01 till S. Massberg), ERA-NET om hjärt-kärlsjukdomar (ERA-CVD; 01KL1910 till S. Clauss) och Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (till S. Clauss). Finansiärerna hade ingen roll i manuskriptförberedelserna.
Materials
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | vwr | 10836-004 | |
| Leica microscope | Leica microsystems | Leica DM6 | |
| Flow cytometry machine | |||
| Beckman Coulter | Beckman coulter | MoFlo Astrios | |
| Software | |||
| FlowJo v10 | FlowJo | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | FALCON | 352070 | |
| Cover slips | Thermo scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Component of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| Collagenase I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| HEPES buffer | Sigma | H4034 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442-500ml | |
| Penicillin − Streptomycin | Sigma | P4083 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 ml | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 ml/ml | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4) | BioLegend | Cat# 128006 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8) | BioLegend | Cat# 123114 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1) | BioLegend | Cat# 139306 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101226 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11) | BioLegend | Cat# 103106 | diluted to 1:100 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | Charles River Laboratories | ||
Referências
- Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes. Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Gordon, S., Pluddemann, A. Tissue macrophages: heterogeneity and functions. BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nature Immunology. 14 (10), 986-995 (2013).
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Ye Sheng, X., et al. Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
- Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).
- Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
