Vurdering av proteininteraksjoner i levende celler med FRET-sensibilisert utslipp

Summary

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) mellom to fluoroformolekyler kan brukes til å studere proteininteraksjoner i den levende cellen. Her er det gitt en protokoll for hvordan man måler FRET i levende celler ved å oppdage sensibilisert utslipp av akseptoren og slukke donormolekylet ved hjelp av konfokal laserskanningsmikroskopi.

Abstract

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) er den strålingsfrie overføringen av energi fra en eksitert donor til et akseptormolekyl og avhenger av molekylets avstand og orientering, samt omfanget av overlapping mellom donorutslipp og akseptorabsorpsjonsspektra. FRET tillater å studere samspillet mellom proteiner i levende celle over tid og i forskjellige subcellulære rom. Ulike intensitetsbaserte algoritmer for å måle FRET ved mikroskopi er beskrevet i litteraturen. Her er en protokoll og en algoritme gitt for å kvantifisere FRET-effektivitet basert på måling av både sensibilisert utslipp av akseptoren og slukking av donormolekylet. Kvantifiseringen av ratiometrisk FRET i den levende cellen krever ikke bare bestemmelse av crosstalk (spektral spill-over, eller bleed-through) av fluorescerende proteiner, men også deteksjonseffektiviteten til det mikroskopiske oppsettet. Protokollen som er gitt her, beskriver hvordan man vurderer disse kritiske parametrene.

Introduction

Mikroskopibasert analyse av Förster Resonance Energy Transfer (FRET) gjør det mulig å vurdere interaksjoner mellom proteiner i levende celler. Det gir romlig og tidsmessig informasjon, inkludert informasjon om hvor i cellen og i hvilket subcellulært rom interaksjonen finner sted, og om denne interaksjonen endres over tid.

Theodor Förster la det teoretiske grunnlaget for FRET i 1948¹. FRET er en strålingsfri overføring av energi fra en eksitert donor til et akseptormolekyl og avhenger av avstanden til molekylene og den relative orienteringen av deres overgangsdipoler, samt overlappingen mellom donorutslipp og akseptorabsorpsjonsspektra. Hastigheten av energioverføring er omvendt proporsjonal med den sjette kraften i donor-akseptoravstanden. Dermed kan FRET brukes til å måle molekylær nærhet i området 1-10 nm.

FRET konkurrerer med andre de-eksitasjonsprosesser av donormolekylet og resulterer i såkalt donor-quenching og sensibilisert utslipp av akseptoren. Donor-quenching er en reduksjon av antall utstrålede donorfotoner, mens sensibilisert utslipp er en økning i utsendte akseptorfotoner. Mange mikroskopiske FRET-analyser bruker fluorescensintensitetsmålinger, inkludert akseptorfotobleking 2, donorfotobleking² eller FRET-sensibilisert fotobleking av akseptoren³.

Her presenteres en trinnvis eksperimentell protokoll og matematisk algoritme for å kvantifisere FRET ved hjelp av donorslukking og akseptorsensibilisert utslipp^4,5, en metode som ofte refereres til som ratiometrisk FRET. Mange protokoller om hvordan man tilnærmer seg sensibilisert utslipp har blitt publisert, få har kvantifisert den absolutte FRET-effektiviteten 6,7,8,9. Kvantifiseringen av FRET-effektivitet i den levende cellen krever bestemmelse av (i) crosstalk (spektral spill-over, eller bleed-through) av fluorescerende proteiner og også (ii) deteksjonseffektiviteten til det mikroskopiske oppsettet. Mens crosstalk kan vurderes ved å avbilde celler som uttrykker bare en av fluoroforene, er vurderingen av den relative deteksjonseffektiviteten til donoren og akseptorfluorescensen mer komplisert. Det krever kunnskap om minst forholdet mellom antall donor- og akseptormolekyler som gir opphav til de målte signalene. Antallet fluoroforer uttrykt i levende celler varierer imidlertid fra celle til celle og er ukjent. Den såkalte α-faktoren karakteriserer de relative signalstyrkene fra et enkelt eksitert donor- og akseptormolekyl. Kunnskap om faktoren er en forutsetning for kvantitative ratiometriske FRET-målinger i prøver med variable akseptor-til-donor-molekylforhold som påtruffet under levende celleavbildning med fluorescerende proteiner. Ved å bruke et 1-til-1 donor-akseptorfusjonsprotein som en kalibreringssonde kan bestemmelsen av den α faktoren og fungerer også som en positiv kontroll. Denne genetisk koblede sonden uttrykkes av celler i ukjente totale mengder, men i en fast og kjent relativ mengde en-til-en. Følgende protokoll beskriver hvordan man konstruerer 1-til-1-sonden og hvordan man bruker den til kvantifisering av FRET-effektivitet. Et regneark som inneholder alle formler finnes i tillegget og kan brukes av leserne til å legge inn sine egne målinger i de respektive kolonnene som beskrevet nedenfor.

Mens protokollen bruker GFP-Cherry donor / akseptorpar, kan den presenterte tilnærmingen utføres med et hvilket som helst annet FRET-par. Tilleggsfil 1 gir detaljer om cyangule par.

Protocol

1. Plasmid konstruksjon For å generere eGFP-mCherry1-fusjonssonden, bruk en N1 pattedyrcelleekspresjonsvektor (se materialfortegnelse) med mCherry110 satt inn ved hjelp av restriksjonsstedene AgeI og BsrGI. Bruk følgende oligonukleotider til å forsterke eGFP11 uten stoppkodon som SalI-BamHI fragment: N-terminal primer 5′-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3′ og C-terminal primer 5′-AAT ATA TGG ATC…

Representative Results

Figur 1 viser bildene tatt i henholdsvis donorkanalen, kanal 1 (488, 505-530 nm), overføringskanalen, kanal 2 (488, >585 nm) og akseptorkanalen, kanal 3 (561, >585 nm). Representative bilder av celler som kun uttrykker GFP, kun kirsebær, som uttrykker GFP og kirsebær, og uttrykker GFP-kirsebærfusjonsproteinet. De gjennomsnittlige cellulære FRET-effektivitetene beregnet i NRK-celler som uttrykker GFP-kirsebærfusjonsprotein (positiv kontroll, figur 2A) og…

Discussion

Den presenterte protokollen beskriver bruken av den genetisk koblede en-til-en fluorescerende proteinkalibreringssonden for kvantifisering av FRET ved påvisning av sensibilisert utslipp av akseptoren og slukking av donormolekylet ved konfokalmikroskopi. Denne metoden kan brukes til å vurdere proteininteraksjoner i den levende cellens fysiologiske sammenheng i forskjellige subcellulære rom. Romlig oppløsning kan forbedres ytterligere ved å bruke den presenterte algoritmen til å beregne FRET-effektivitet i hver pikse…

Materials

0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x)	Thermo Fisher Scientific	15400054
Clontech mCherry N1 vector	Addgene	3553
DMEM without phenol red	Thermo Fisher Scientific	11054020
Fugene 6	Promega	E2691
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630080
LabTek 8-well chambers #1.0	Thermo Fisher Scientific	12565470
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081