Vi har utviklet en enkel og billig protokoll for å laste Cas9 / single-guide RNA (sgRNA) ribonucleoprotein komplekser innen viruslignende partikler. Disse partiklene, kalt “Nanoblades”, tillater effektiv levering av Cas9 / sgRNA-komplekset i udødelige og primære celler så vel som in vivo.
Det grupperte regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR)-Cas-systemet har demokratisert genomredigering i eukaryote celler og førte til utvikling av mange innovative applikasjoner. Levering av Cas9-proteinet og enveis RNA (sgRNA) i målceller kan imidlertid være teknisk utfordrende. Klassiske virale vektorer, for eksempel de som er avledet fra lentivirus (LVs) eller adeno-assosierte virus (AAVs), muliggjør effektiv levering av transgeneskoding for Cas9-proteinet og dets tilhørende sgRNA i mange primære celler og in vivo. Likevel kan disse vektorene lide av ulemper som integrering av transgene i målcellegenomet, begrenset lastekapasitet og langsiktig uttrykk for Cas9-proteinet og guide RNA i målceller.
For å overvinne noen av disse problemene ble en leveringsvektor basert på murin Leukemia-viruset (MLV) utviklet for å pakke Cas9-proteinet og den tilhørende guiden RNA i fravær av kodingstransgene. Ved å fusjonere Cas9-proteinet til C-terminus av strukturproteinet Gag fra MLV, ble viruslignende partikler (VLPer) lastet med Cas9-proteinet og sgRNA (kalt “Nanoblades”) dannet. Nanoblader kan samles inn fra kulturmediet til produsentceller, renses, kvantifiseres og brukes til å transdusere målceller og levere det aktive Cas9/sgRNA-komplekset. Nanoblader leverer sin ribonucleoprotein (RNP) last forbigående og raskt i et bredt spekter av primære og udødelige celler og kan programmeres for andre applikasjoner, for eksempel forbigående transkripsjonsaktivering av målrettede gener, ved hjelp av modifiserte Cas9-proteiner. Nanoblader er i stand til in vivo genomredigering i leveren av injiserte voksne mus og i oocytter for å generere transgene dyr. Til slutt kan de bli komplekset med donor-DNA for “transfection-free” homologi-rettet reparasjon. Nanoblade forberedelse er enkel, relativt rimelig, og kan enkelt utføres i ethvert cellebiologisk laboratorium.
Sammenlignet med andre programmerbare nukleaser forenklet CRISPR-Cas-systemet dramatisk og demokratiserte prosedyren for sekvensspesifikk genommålretting og spalting i eukaryote celler. Gjennom det enkle uttrykket av en sgRNA kan brukere programmere Cas9-proteinet (eller optimaliserte varianter) for nesten alle cellulære locus1. I dette scenariet blir levering av Cas9-proteinet og sgRNA hovedbegrensningen når du utfører stedsstyrt mutagenese. I udødelige celler kan sgRNA og Cas-proteinet lett uttrykkes fra transfiserte plasmider for å oppnå effektiv genommålretting i de fleste celler. Konstituerende uttrykk for Cas9/sgRNA-komplekset kan imidlertid øke off-target aktiviteten til Cas9-proteinet og introdusere uønskede endringer i ikke-spesifikk loci2. I primærceller kan DNA-transfeksjon være teknisk vanskelig å oppnå og føre til dårlig uttrykk eller en liten prosentandel av transfekterte celler. Alternativer til klassisk DNA-transfeksjon omfatter bruk av virale vektorer som leverer en transgene koding for Cas9 og sgRNA eller elektroporasjon av rekombinant Cas9-protein koblet til en syntetisk sgRNA. Imidlertid kan disse tilnærmingene føre til transgene integrasjon i cellevertens genom (som det er tilfelle for klassiske retrovirale og lentivirale uttrykksvektorer), begrensning av cellulære faktorer, og føre til konstituerende uttrykk for Cas9-proteinet og sgRNA.
Elektroporasjon av Cas9/sgRNA RNP-komplekset kan overvinne de fleste av disse problemene og føre til effektiv og forbigående levering i primærceller og in vivo, samt tillate en doseavhengig respons. Likevel er det vanligvis avhengig av dyrt utstyr og reagenser og er også vanskelig å oppskalere hvis et stort antall celler må behandles. Som et alternativ til de ovennevnte teknikkene har disse forfatterne utviklet “Nanoblades”-en retroviral leveringsvektor for Cas9-proteinet og sgRNA3 som er konseptuelt lik andre viral-avledede capsid proteinleveringssystemer4,5,6,7,8. Nanoblader utnytter den naturlige kapasiteten til Gag-polyproteinet fra retrovirus for å produsere, når de uttrykkes alene i dyrkede celler, VIP-er som frigjøres i det ekstracellulære mediet9. Ved å fusjonere Cas9-proteinet til C-terminalenden av murin leukemiviruset (MLV) Gag polyprotein og samtidig uttrykke sgRNA og virale konvoluttglykoproteiner, kan Cas9-proteinet innkapsles innen utgitte VLPer eller Nanoblades. Ved rensing kan Nanobladene inkuberes med målceller eller injiseres in vivo for å megle raskt, forbigående og doseavhengig levering av Cas9/sgRNA RNP-komplekset3.
Nanoblader kan programmeres med flere sgRNAer for samtidig redigering på forskjellige loci eller med Cas9-varianter for å utføre andre applikasjoner som målspesifikk transkripsjonsaktivering eller undertrykkelse3. I motsetning til proteinelektroporasjon, som er avhengig av rekombinant uttrykk, kan nylig beskrevne Cas-varianter fra litteraturen lett klones inn i Gag fusion-uttrykksvektoren, noe som gjør den til en allsidig plattform. Nanoblader kan bli ytterligere kompleks eller lastet med enkeltstrengede og dobbeltstrengede oligodeoksynukleotider (ssoder) for å utføre homologi-rettet reparasjon3. Nanoblade produksjon er relativt enkel og billig. Videre kan Nanoblades lagres ved 4 °C i mange dager eller ved -80 °C for langtidslagring. Vanligvis formidler Nanoblades effektiv, transgenefri genomredigering i de mest udødelige og primære dyrkede cellene. Noen primærceller kan imidlertid være følsomme for tilstedeværelsen av viruspartikler, noe som resulterer i økt dødelighet. Celler i det medfødte immunsystemet kan også reagere på tilstedeværelsen av Nanoblades (på grunn av deres virale opprinnelse) og bli aktivert. I disse tilfellene må transduksjonsprotokollen optimaliseres for å begrense eksponeringstiden for Nanoblades og minimere ikke-spesifikke effekter. Nanoblader representerer et levedyktig og lett å implementere alternativ til andre tilgjengelige CRISPR-leveringsmetoder.
Nanoblader muliggjør rask og doseavhengig levering av Cas9/sgRNA RNP-komplekset i cellelinjer og primærceller. I motsetning til klassisk transfeksjon og andre virale leveringsvektorer, men som proteinelektroporasjon, har Nanoblades fordelen av forbigående levering av Cas9 / sgRNA RNP på en transgenefri måte. Nanoblader tilbyr en svært allsidig, enkel og rimelig plattform for proteinlevering som enkelt og raskt kan tilpasses den stadig voksende familien av CRISPR-varianter. Nanoblader kan produseres i HEK293T-cellelinjen eller dets derivater. HEK293T cellelinjer som brukes her er utviklet for å maksimere retroviral og lentiviral partikkelproduksjon (se materialtabellen). Selv om andre kilder til HEK293T-celler kan være egnet, må brukerne imidlertid teste og sammenligne HEK293T-celler fra forskjellige kilder, da store forskjeller i partikkelproduksjon er observert avhengig av HEK293T-cellekilden. Celler må også kontrolleres for Mycoplasma-forurensning ofte og passerer hver tredje dag (klassisk 1/8 fortynning) for å unngå overkonfluens, noe som har en negativ innvirkning på partikkelproduksjonen.
Celler bør ikke opprettholdes for over 20 passasjer. DMEM supplert med glukose, penicillin/streptomycin, glutamin og 10 % dekomplementert fostersvinserum ble brukt til cellekultur. Siden serumopprinnelse kan påvirke kvaliteten på Nanoblade-preparatet, bør forskjellige partier serum testes før storskala produksjon. Nanoblader kan produseres effektivt i andre medier som RPMI eller serumfrie modifikasjoner av minimum viktig medium som kan erstatte DMEM dagen etter transfeksjon. Som angitt nedenfor, selv om middels erstatning etter transfeksjon med noen DNA-transfeksjonsreagenser er valgfritt, kan det være gunstig å endre mediet som VLPene frigjøres i, spesielt for å begrense serumspor i partikkelpreparatet. Dyrking av celler i redusert serum minimum viktig medium dagen før transfeksjon er ennå ikke forsøkt.
Som nevnt produseres Nanoblades ved overekspressering av en blanding av plasmider i produsentceller. Overtrykket ser ut til å være nødvendig for optimal produksjon. Faktisk utviklet dette laboratoriet en produsentcellelinje der Gag-Pol-uttrykkende konstruksjon ble stabilisert ved antibiotikavalg; Dette systemet klarte imidlertid ikke å produsere betydelige mengder Nanoblades. En lignende observasjon ble gjort da sgRNA-kodingskonstruksjonen ble stabilt integrert i genomet til produsentceller. Som beskrevet for andre partikkelproduksjonssystemer, kan en stabil cellelinje som uttrykker minst noen konstruksjoner involvert i Nanoblades-produksjonen være nyttig; Dette vil imidlertid sikkert kreve behandling av store mengder supernatant og en passende teknikk for å rense partikler. Protokollen ovenfor skisserer den foretrukne prosedyren for å produsere Nanoblades som utnytter spesifikke transfeksjonsreagenser (se materialtabellen).
Selv om transfeksjonsreagenser fra andre produsenter også har blitt testet med suksess, følger de aller fleste av denne gruppens resultater med Nanoblades prosedyren som er beskrevet her. Lavkostnadstransfeksjon kan oppnås ved hjelp av kalsiumfosfatreagenser og gi god produksjonseffektivitet; Denne metoden krever imidlertid absolutt utskifting av transfeksjonsmedium dagen etter transfeksjon og kan etterlate kalsiumfosfatrester i sedimentert partikkelpreparat. I samsvar med nødvendigheten av høye uttrykksnivåer for Nanoblade-komponenter i produsentceller er observasjonen at mengden sgRNAer forbundet med Cas9-proteinet kan være en begrensende faktor for effektiv genomredigering. For å forbedre sgRNA-lasting har to tekniske tilnærminger nylig blitt utviklet av uavhengige grupper ved hjelp av proteinleveringsvektorer som ligner nanoblader. Disse er avhengige av bruk av T7 polymeraseavhengig cytoplasmisk uttrykk for sgRNA6 eller gjennom tilsetning av et retroviralt innkapslingssignal til sgRNA-sekvensen for å megle binding til Gag polyprotein6. Disse tilnærmingene kan faktisk forbedre sgRNA-lasting i Nanoblades selv om de ikke er testet ennå.
Transduksjon av målceller er et kritisk trinn i prosedyren. I de fleste udødelige cellelinjer har transduksjon med Nanoblades liten eller ingen cytopatisk effekt. Men i primære celler kan toksisitet være et problem. Transduksjon må derfor optimaliseres for hver celletype. Spesielt er eksponeringstiden for Nanoblades en viktig faktor for å endre når du optimaliserer transduksjonsprotokollen. For følsomme celler som primære nevroner eller benmargsceller, gir 4-6 h inkubasjon med Nanoblades før du erstatter mediet, effektiv levering av Cas9-proteinet samtidig som celletoksisitet minimeres. Videre kan adjuvanser som kationiske polymerer, blant annet, forbedre effektiviteten av transduksjon i noen celler (se materialtabellen). Det er viktig å merke seg at Nanoblades er VLPer og kan indusere en immunogen respons. Dette kan være en begrensning hvis du arbeider med visse typer primærceller, for eksempel makrofager eller dendrittiske celler, der inkubasjon med Nanoblades kan indusere viktige endringer i genuttrykk og fenotypen til cellene. Hvis makrofager og dendrittiske celler er avledet fra hematopoietiske stamcelleforløpere (for eksempel musebenmargsceller), er det å foretrekke å transdusere celler med Nanoblades før de er fullt differensiert for å unngå å indusere en cellulær respons mot Nanoblades. Ellers kan Cas9 proteinelektroporasjon representere et levedyktig alternativ når du arbeider med differensierte immunceller.
Nanoblader kan brukes in vivo for å transdusere muszygoter eller embryoer for å generere transgene dyr. I likhet med klassiske retrovirale eller lentivirale vektorer, kan de også injiseres direkte i vev fra voksne dyr. Nanoblades (lik retrovirale og lentivirale vektorer) kan imidlertid inaktiveres av vertsdyrets immunrespons; Derfor må dosen som skal injiseres optimaliseres for hver applikasjon. Denne immunresponsen kan også begrense fordelingen av funksjonelle VLPer til vev nær injeksjonsstedet. Til slutt, i motsetning til lentivirale vektorer, er Nanoblades transgenefrie og leverer Cas9 i en begrenset tidsramme. Derfor kan de ikke brukes til å utføre genomomfattende funksjonelle screeninger som krever sekvensering av sgRNAer med høy gjennomstrømning ved valg av celler. Nanoblader er nyttige når rask, doseavhengig og transgenefri genomredigering er nødvendig20. Videre, i likhet med proteinelektroporasjon, fører Nanoblades til færre off-target effekter enn langvarig uttrykk for Cas9 / sgRNA gjennom DNA-transfeksjon eller klassiske virale vektorer3. Fremtidig utvikling av Nanoblades er fokusert på å innlemme Cas9-varianter for forskjellige teknologiske applikasjoner som baseredigering og RNA-målretting.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av Labex Ecofect (ANR-11-LABX-0048) av Université de Lyon, innenfor programmet Investissements d’Avenir (ANR-11-IDEX-0007) drevet av det franske nasjonale forskningsbyrået (ANR), Fondation FINOVI, Agence Nationale des Recherches sur le SIDA et les Hépatites Virales (ANRS-ECTZ3306) og av Det europeiske forskningsrådet (ERC-StG-LS6-805500 til E.P.R.) under EUs forsknings- og innovasjonsprogrammer Horizon 2020.
13.2 mL, Thinwall Polypropylene Tubes, 14 x 89 mm – 50Pk | Beckman Coulter Life Sciences | 331372 | Ultracentrifugation tubes for Nanoblades purification |
Amersham Protran Premium Western blotting membranes, nitrocellulose | Merck | GE10600004 | Nitrocellulose membrane for quantifying Cas9 levels within purified Nanoblades |
BIC-Gag-CAS9 | Addgene | 119942 | Encodes a GAG (F-MLV)-CAS9(sp) fusion. Allows the production of GAG-CAS9 Virus like particles from producer cells in association with over expressed gRNA(s) and appropriate envelopes |
BICstim-Gag-dCAS9-VPR | Addgene | 120922 | Encodes a GAG-dCAS9-VPR fusion for targeted transcriptional activation |
BLADE | Addgene | 134912 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in Nanoblades system |
BsmBI-v2 | New England Biolabs | R0739S | Restriction enzyme to digest the BLADE and SUPERBLADES vectors for sgRNA cloning |
Cas9 (7A9-3A3) Mouse mAb (HRP Conjugate) #97982 | Cell Signaling Technology | 97982S | Anti-Cas9 antibody for Cas9 quantification by dot-blot |
Cas9 Nuclease, S. pyogenes | New England Biolabs | M0386T | Recombinant Cas9 protein to be used as a reference for absolute quantification of the amount of Cas9 loaded within Nanoblades |
Ethidium bromide solution (10 mg/mL in H2O) | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | For staining agarose gels and visualize DNA |
Fisherbrand Wave Motion Shakers | Fisher Scientific | 88-861-028 | Agitation table to resuspend Nanoblades upon centrifugation |
gelAnalyzer | http://www.gelanalyzer.com; quantifying band intensity after digestion | ||
Gesicle Producer 293T | Takara | 632617 | Nanoblades producer cell line |
Gibco DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 41966052 | Cell culture medium for Gesicle Producer 293T cells |
GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7848 | Taq polymerase for amplification of genomic DNA before T7 endonuclease assays |
jetPRIME Transfection Reagent kit for DNA and DNA/siRNA | Polyplus | POL114-15 | Transfection reagent for Nanoblade production in Gesicle Producer 293T cells |
Millex-AA, 0.80 µm, syringe filter | Millipore | SLAA033SS | Syringe filter to remove cellular debris before concentration of Nanoblades |
Millex-GS, 0.22 µm, syringe filter | Millipore | SLGS033SS | Syringe filter to sterilise the sucrose cushion solution |
Millex-HP, 0.45 µm, polyethersulfone, syringe filter | Millipore | SLHP033RS | Syringe filter to remove cellular debris before Nanoblades concentration |
Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020L | DNA gel extraction kit for purification of the pBLADES or pSUPERBLADES plasmid fragment upon digestion with BsmBI |
NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | C3040I | Competent bacteria for plasmid transformation and amplification |
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740410.50 | Maxipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
Nucleospin gDNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.50 | Extraction of genomic DNA from transduced cells |
NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740588.50 | Minipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
NucleoSpin Tissue, Mini kit for DNA from cells and tissue | Macherey-Nagel | 740952.5 | Genomic DNA extraction kit |
Optima XE-90 | Beckman Coulter Life Sciences | A94471 | Ultracentrifuge |
pBaEVRless | Els Verhoeyen (Inserm U1111) | Personnal requests have to be sent to: els.verhoyen@ens-lyon.fr | Baboon Endogenous retrovirus Rless glycoprotein described in Girard-Gagnepain, A. et al. Baboon envelope pseudotyped LVs outperform VSV-G-LVs for gene transfer into early-cytokine-stimulated and resting HSCs. Blood 124, 1221–1231 (2014) |
pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | Enocdes the Murine Leukemia Virus gag and pol genes |
pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | Envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14200091 | 10X PBS to dilute in millipore water |
Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Cationic polymer that enhances the efficiency of retroviral transduction in specific mammalian cells. It can also allow viral-dependent entry of an Oligodeoxynucleotide (ODN) for homology-directed repair |
Sucrose,for molecular biology, ≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389-5KG | Sucrose to prepare a cushion for Nanoblade purification through ultracentrifugation |
SUPERBLADE5 | Addgene | 134913 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in nanoblades system (Optimized for increased genome editing efficiency via Chen B et al., 2013) |
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher Scientific | 34076 | Enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate for Cas9 dot blots |
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | Rotor for ultracentrifugation |
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | Alternative to ethidium bromide for staining agarose gels and visualize DNA |
T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | DNA ligase to ligate the BLADE or SUPERBLADES vectors with the duplexed DNA oligos corresponding to the variable region of the sgRNA |
T7 Endonuclease I | New England Biolabs | M0302S | T7 Endonuclease I recognizes and cleaves non-perfectly matched DNA. Allows to monitor the extent of genome editing at a specific locus |
Triton-containing lysis buffer | Promega | E291A | Lysis buffer to disrupt Nanoblades and allow Cas9 quantification |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | For the preparation of TBST |