Modellering van hersenmetastase via staartaderinjectie van inflammatoire borstkankercellen
Summary
We beschrijven een xenograft muismodel van borstkanker hersenmetastase gegenereerd via staart-ader injectie van een endogene HER2-versterkte inflammatoire borstkankercellijn.
Abstract
Gemetastaseerde verspreiding naar de hersenen is een veel voorkomende en verwoestende manifestatie van vele soorten kanker. Alleen al in de Verenigde Staten worden elk jaar ongeveer 200.000 patiënten gediagnosticeerd met hersenmetastasen. Er is aanzienlijke vooruitgang geboekt bij het verbeteren van de overlevingsresultaten voor patiënten met primaire borstkanker en systemische maligniteiten; De sombere prognose voor patiënten met klinische hersenmetastasen benadrukt echter de dringende noodzaak om nieuwe therapeutische middelen en strategieën tegen deze dodelijke ziekte te ontwikkelen. Het gebrek aan geschikte experimentele modellen is een van de belangrijkste obstakels geweest die de vooruitgang van ons begrip van hersenmetastasebiologie en -behandeling belemmeren. Hierin beschrijven we een xenograft muismodel van hersenmetastase gegenereerd via staart-aderinjectie van een endogene HER2-versterkte cellijn afgeleid van inflammatoire borstkanker (IBC), een zeldzame en agressieve vorm van borstkanker. Cellen werden gelabeld met vuurvlieg luciferase en groen fluorescentie-eiwit om hersenmetastase te controleren en gekwantificeerde metastatische belasting door bioluminescentie beeldvorming, fluorescerende stereomicroscopie en histologische evaluatie. Muizen ontwikkelen robuust en consistent hersenmetastasen, waardoor onderzoek van belangrijke mediatoren in het metastatische proces en de ontwikkeling van preklinisch testen van nieuwe behandelingsstrategieën mogelijk is.
Introduction
Hersenmetastase is een veel voorkomende en dodelijke complicatie van systemische maligniteiten. De meeste hersenmetastasen zijn afkomstig van primaire tumoren van de long, borst of huid, die samen goed zijn voor 67-80% van de gevallen 1,2. Schattingen van de incidentie van hersenmetastasen variëren van 100.000 tot 240.000 gevallen, en deze aantallen kunnen worden onderschat omdat autopsie zeldzaam is voor patiënten die stierven aan uitgezaaide kanker3. Patiënten met hersenmetastasen hebben een slechtere prognose en een lagere totale overleving ten opzichte van patiënten zonder hersenmetastasen4. De huidige behandelingsopties voor hersenmetastasen zijn grotendeels palliatief en verbeteren de overlevingsresultaten voor de meeste patiëntenniet 5. Hersenmetastase blijft dus een uitdaging en de noodzaak blijft dringend om de mechanismen van hersenmetastaseprogressie beter te begrijpen om effectievere therapieën te ontwikkelen.
Het gebruik van experimentele modellen heeft belangrijke inzichten opgeleverd in specifieke mechanismen van borstkanker gemetastaseerde progressie naar de hersenen en heeft de evaluatie van de werkzaamheid van verschillende therapeutische benaderingen mogelijk gemaakt 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 . Er zijn echter maar weinig modellen die de fijne kneepjes van de ontwikkeling van hersenmetastase nauwkeurig en volledig kunnen samenvatten. Verschillende experimentele in vivo modellen zijn gegenereerd via inenting van kankercellen in muizen via verschillende toedieningswegen, waaronder orthotopische, staartader-, intracardiale, intracarotis-arteriële en intracerebrale injecties. Elke techniek heeft voor- en nadelen, zoals elders besproken3. Geen van deze muismodellen kan echter de klinische progressie van hersenmetastase volledig repliceren.
Hersenmetastasen komen vooral vaak voor bij patiënten met inflammatoire borstkanker (IBC), een zeldzame maar agressieve variant van primaire borstkanker. IBC is goed voor 1% tot 4% van de gevallen van borstkanker, maar het is verantwoordelijk voor een onevenredige 10% van de borstkankergerelateerde sterfgevallen in de Verenigde Staten17,18. Van IBC is bekend dat het snel metastaseert; inderdaad, een derde van de IBC-patiënten heeft metastasen op afstand op het moment van diagnose19,20. Specifiek voor hersenmetastase hebben patiënten met IBC een hogere incidentie van hersenmetastase dan patiënten met niet-IBC21. Onlangs hebben we aangetoond dat de MDA-IBC3-cellijn, afgeleid van de kwaadaardige pleurale effusievloeistof van een patiënt met ER-/PR-/HER2+ IBC die IBC-kenmerken in xenografts van muizen samenvat, een verhoogde neiging heeft om hersenmetastasen te ontwikkelen in plaats van longmetastasen bij muizen wanneer ze worden geïnjecteerd door staartader, waardoor deze cellijn een goed model is voor het bestuderen van de ontwikkeling van hersenmetastase16.
Hierin beschrijven we de procedures om hersenmetastase te genereren via staart-aderinjectie van MDA-IBC3-cellen en om de metastatische belasting te evalueren via stereofluorescente microscopie en luciferasebeeldvorming. Deze methode is gebruikt om belangrijke mediatoren van borstkankermetastase naar de hersenen te ontdekken en om de werkzaamheid van therapeutische interventies te testen 16,22,23. Het nadeel van deze techniek is dat het niet alle stappen in het metastatische proces van de hersenen samenvat. Niettemin zijn de belangrijkste voordelen robuustheid en reproduceerbaarheid, betrokkenheid van de relevante metastasebiologie van intravasatie, het doorkruisen van de longen en extravasatie in de hersenen, en de relatieve eenvoud in termen van techniek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol bevat verschillende kritieke stappen. Cellen mogen niet langer dan 1 uur op ijs worden gehouden om de levensvatbaarheid te behouden. Alcoholwattenschijfjes moeten worden gebruikt om de staarten van de muizen af te vegen vóór injectie, met zorg ervoor dat ze niet te hard of te vaak afvegen om te voorkomen dat de staarthuid wordt beschadigd. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn in de celsuspensie, om te voorkomen dat muizen sterven aan bloedvatembolieën. Houd de injectiehoek op 45° of minder o…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken Christine F. Wogan, MS, ELS, van MD Anderson’s Division of Radiation Oncology voor de wetenschappelijke bewerking van het manuscript, en Carol M. Johnston van MD Anderson’s Division of Surgery Histology Core voor hulp bij hematoxyline en eosine kleuring. We zijn de kern diergeneeskunde en chirurgie van MD Anderson dankbaar voor hun steun voor de dierstudies. Dit werk werd ondersteund door de volgende beurzen: Susan G. Komen Career Catalyst Research grant (CCR16377813 naar BGD), American Cancer Society Research Scholar grant (RSG-19-126-01 naar BGD) en het State of Texas Rare and Aggressive Breast Cancer Research Program. Ook gedeeltelijk ondersteund door Cancer Center Support (Core) Grant P30 CA016672 van het National Cancer Institute, National Institutes of Health, naar het MD Anderson Cancer Center van de Universiteit van Texas.
Materials
| Cell Culture | |||
| 1000 µL pipette tip filtered | Genesee Scientific | 23430 | |
| 10 mL Serological Pipets | Genesee Scientific | 12-112 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | 1% |
| Centrifuge tubes 15 mL bulk | Genesee Scientific | 28103 | |
| Corning 500 mL Hams F-12 Medium [+] L-glutamine | GIBICO Inc. USA | MT10080CV | |
| Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Eppendorf centufuge 5810R | Eppendorf | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBICO Inc. USA | 16000044 | 10% |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers (40 μm) | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1 µg/mL |
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | 5 µg/mL |
| Invitrogen Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| MDA-IBC3 cell lines | MD Anderson Cancer Center | Generated by Dr. Woodward's lab24 | |
| Luciferase–green fluorescent protein (Luc–GFP) plasmid | System Biosciences | BLIV713PA-1 | |
| microtubes clear sterile 1.7 mL | Genesee Scientific | 24282S | |
| Olympus 10 µL Reach Barrier Tip, Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 23-401C | |
| TC Treated Flasks (T75), 250mL, Vent | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Tail vein injection | |||
| C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J – SCID/Beige | Envigo | SCID/beige mice | |
| BD Insulin Syringe with the BD Ultra-Fine Needle 0.5mL 30Gx1/2" (12.7mm) | BD | 328466 | |
| Plas Labs Broome-Style Rodent Restrainers | Plas Labs 551BSRR | 01-288-32A | Order fromThermo Fisher Scientific |
| Volu SolSupplier Diversity Partner Ethanol 95% SDA (190 Proof) | Thermo Fisher Scientific | 50420872 | 70 % used |
| Imaging | |||
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| Disposable PES Filter Units 0.45 µm | Fisherbrand | FB12566501 | filter system to sterilize the D-luciferin |
| D-Luciferin | Biosynth | L8220-1g | stock concentration = 47.6 mM (15.15 mg/mL); use concentration = 1.515 mg/mL |
| 1.7 mL microtube amber | Genesee Scientific | 24-282AM | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC-14043-704-06 | Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer |
| IVIS 200 | PerkinElmer | machine for luciferase imaging, up to 5 mice imaging at the same time, with anesthesia machine | |
| Plastic Containers with Lids | Fisherbrand | 02-544-127 | |
| Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 1000957 | |
| Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
| Stereomicroscope Imaging | |||
| Stereomicroscope AZ100 | Nikon | model AZ-STGE | software NIS-ELEMENT |
| Formalin 10% | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| TC treated dishes 100×20 mm | Genesee Scientific | 25202 |
Referências
- Achrol, A. S., et al. Brain metastases. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 5 (2019).
- Nayak, L., Lee, E. Q., Wen, P. Y. Epidemiology of brain metastases. Current Oncology Report. 14 (1), 48-54 (2012).
- Lowery, F. J., Yu, D. Brain metastasis: Unique challenges and open opportunities. Biochimica et Biophysica Acta Review Cancer. 1867 (1), 49-57 (2017).
- Brufsky, A. M., et al. Central nervous system metastases in patients with HER2-positive metastatic breast cancer: incidence, treatment, and survival in patients from registHER. Clinical Cancer Research. 17 (14), 4834-4843 (2011).
- Valiente, M., et al. The evolving landscape of brain metastasis. Trends in Cancer. 4 (3), 176-196 (2018).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Woditschka, S., et al. DNA double-strand break repair genes and oxidative damage in brain metastasis of breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 106 (7), (2014).
- Palmieri, D., et al. Vorinostat inhibits brain metastatic colonization in a model of triple-negative breast cancer and induces DNA double-strand breaks. Clinical Cancer Research. 15 (19), 6148-6157 (2009).
- Kim, S. J., et al. Astrocytes upregulate survival genes in tumor cells and induce protection from chemotherapy. Neoplasia. 13 (3), 286-298 (2011).
- Zhang, S., et al. SRC family kinases as novel therapeutic targets to treat breast cancer brain metastases. Pesquisa do Câncer. 73 (18), 5764-5774 (2013).
- Valiente, M., et al. Serpins promote cancer cell survival and vascular co-option in brain metastasis. Cell. 156 (5), 1002-1016 (2014).
- Gril, B., et al. Effect of lapatinib on the outgrowth of metastatic breast cancer cells to the brain. Journal of the National Cancer Institute. 100 (15), 1092-1103 (2008).
- Gril, B., et al. Pazopanib reveals a role for tumor cell B-Raf in the prevention of HER2+ breast cancer brain metastasis. Clinical Cancer Research. 17 (1), 142-153 (2011).
- Palmieri, D., et al. Profound prevention of experimental brain metastases of breast cancer by temozolomide in an MGMT-dependent manner. Clinical Cancer Research. 20 (10), 2727-2739 (2014).
- Priego, N., et al. STAT3 labels a subpopulation of reactive astrocytes required for brain metastasis. Nature Medicine. 24 (7), 1024-1035 (2018).
- Debeb, B. G., et al. miR-141-mediated regulation of brain metastasis from breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 108 (8), (2016).
- Chang, S., Parker, S. L., Pham, T., Buzdar, A. U., Hursting, S. D. Inflammatory breast carcinoma incidence and survival: the surveillance, epidemiology, and end results program of the National Cancer Institute, 1975-1992. Cancer. 82 (12), 2366-2372 (1998).
- Hance, K. W., Anderson, W. F., Devesa, S. S., Young, H. A., Levine, P. H. Trends in inflammatory breast carcinoma incidence and survival: the surveillance, epidemiology, and end results program at the National Cancer Institute. Journal of National Cancer Institute. 97 (13), 966-975 (2005).
- Dirix, L. Y., Van Dam, P., Prove, A., Vermeulen, P. B. Inflammatory breast cancer: Current understanding. Current Opinion in Oncology. 18 (6), 563-571 (2006).
- Wang, Z., et al. Pattern of distant metastases in inflammatory breast cancer – A large-cohort retrospective study. Journal of Cancer. 11 (2), 292-300 (2020).
- Uemura, M. I., et al. Development of CNS metastases and survival in patients with inflammatory breast cancer. Cancer. 124 (11), 2299-2305 (2018).
- Smith, D. L., Debeb, B. G., Thames, H. D., Woodward, W. A. Computational modeling of micrometastatic breast cancer radiation dose response. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 96 (1), 179-187 (2016).
- Fukumura, K., et al. Multi-omic molecular profiling reveals potentially targetable abnormalities shared across multiple histologies of brain metastasis. Acta Neuropathol. , (2021).
- Klopp, A. H., et al. Mesenchymal stem cells promote mammosphere formation and decrease E-cadherin in normal and malignant breast cells. PLoS One. 5 (8), 12180 (2010).
- Villodre, E. S., et al. Abstract P3-01-10: Ndrg1-egfr axis in inflammatory breast cancer tumorigenesis and brain metastasis. Pesquisa do Câncer. 80 (4), 10 (2020).
