3D-utskrift av In Vitro Hydrogel Microcarriers ved vekslende Viscous-Inertial Force Jetting

Summary

Presentert her er en mild 3D-utskriftsteknikk drevet av vekslende viskøse inertialkrefter for å muliggjøre bygging av hydrogelmikrokarrierer. Hjemmelagde dyser gir fleksibilitet, noe som gir enkel utskifting for forskjellige materialer og diametre. Cellebindende mikrokarrierer med en diameter på 50-500 μm kan oppnås og samles for videre dyrking.

Abstract

Mikrokarrierer er perler med en diameter på 60-250 μm og et stort spesifikt overflateareal, som ofte brukes som bærere for store cellekulturer. Mikrokarrierekulturteknologi har blitt en av de viktigste teknikkene innen cytologisk forskning og brukes ofte innen storskala celleutvidelse. Mikrokarrierer har også vist seg å spille en stadig viktigere rolle i in vitro vev engineering konstruksjon og klinisk narkotika screening. Nåværende metoder for å forberede mikrokarrierer inkluderer mikrofluidiske sjetonger og blekkskriverutskrift, som ofte er avhengige av kompleks strømningskanaldesign, et inkompatibelt tofaset grensesnitt og en fast dyseform. Disse metodene står overfor utfordringene ved kompleks dysebehandling, ubeleilige dyseendringer og overdreven ekstruderingskrefter når de brukes på flere bioink. I denne studien ble en 3D-utskriftsteknikk, kalt vekslende viskøs-inertial kraftstråle, brukt for å muliggjøre bygging av hydrogelmikrokarrierer med en diameter på 100-300 μm. Celler ble senere sådd på mikrokarrierer for å danne vevsteknikkmoduler. Sammenlignet med eksisterende metoder, tilbyr denne metoden en gratis dysespissdiameter, fleksibel dyseveksling, fri kontroll av utskriftsparametere og milde utskriftsforhold for et bredt spekter av bioaktive materialer.

Introduction

Mikrokarrierer er perler med en diameter på 60-250 μm og et stort spesifikt overflateareal og brukes ofte til storskala kultur av ^celler1,2. Deres ytre overflate gir rikelig vekststeder for celler, og interiøret gir en støttestruktur for romlig spredning. Den sfæriske strukturen gir også bekvemmelighet i overvåking og kontroll av parametere, inkludert pH, _O2 og konsentrasjon av næringsstoffer og metabolitter. Når mikrokarrierer brukes i kombinasjon med omrørte tankbioreaktorer, kan de oppnå høyere celletetthet i et relativt lite volum sammenlignet med konvensjonelle kulturer, og dermed gi en kostnadseffektiv måte å oppnå store ^kulturer3 på. Mikrocarrier kulturteknologi har blitt en av de viktigste teknikkene innen cytologisk forskning, og mye fremgang har blitt gjort innen storskala utvidelse av stamceller, hepatocytter, kondrocytter, fibroblaster og andre ^strukturer4. De har også vist seg å være ideelle legemiddelleveringskjøretøy og nedenfra-og-opp-enheter, og tar derfor en stadig viktigere rolle i klinisk legemiddelscreening og in vitro vevsteknikk ^reparasjon5.

For å møte mekaniske eiendomskrav i ulike scenarier er flere typer hydrogelmaterialer utviklet for bruk i bygging av mikrokarrierer6,7,8,9,10,11. Alginat- og hyaluronsyre (HA) hydrogeler er to av de mest brukte mikrokarrierematerialene på grunn av deres gode biokompatibilitet og ^{krysskoblingsevne12,13}. Alginat kan enkelt krysskobles av kalsiumklorid, og dets mekaniske egenskaper kan moduleres ved å endre krysskoblingstiden. Tyramin-konjugert HA er kryssbundet av oksidativ kobling av tyraminmoieties katalysert av hydrogenperoksid og pepperrotperoksidase14. Kollagen, på grunn av sin unike spiralstruktur og krysskoblede fibernettverk, brukes ofte som en adjuvans for å blande seg inn i mikrokarrierene for å fremme ^{cellevedlegg15,16} ytterligere.

Dagens metoder for å forberede mikrokarrierer inkluderer mikrofluidiske sjetonger, blekkskriverutskrift og elektrospray17,18,19,20,21,22,23. Mikrofluidiske chips har vist seg å være raske og effektive i å produsere ensartede ^{mikrokarrierer24}. Denne teknologien er imidlertid avhengig av en kompleks strømningskanaldesign og ^{fabrikasjonsprosess25}. Høy temperatur eller overdreven ekstruderingskrefter under blekkskrivere, samt intense elektriske felt i elektrospray-tilnærmingen, kan påvirke materialets egenskaper negativt, spesielt dets biologiske ^aktivitet19. Dessuten, når de brukes på ulike biomaterialer og diametre, resulterer de tilpassede dysene som brukes i disse metodene i begrenset prosesseringskompleksitet, høy pris og lav fleksibilitet.

For å gi en praktisk metode for mikrokarriereforberedelse, har en 3D-utskriftsteknikk kalt vekslende viskøse trege krefter jetting (AVIFJ) blitt brukt til å konstruere hydrogelmikrokarrierer. Teknikken benytter nedadgående drivkrefter og statisk trykk generert under vertikal vibrasjon for å overvinne overflatespenningen til dysespissen og dermed danne dråper. I stedet for alvorlige krefter og termiske forhold virker små raske forskyvninger direkte på dysen under utskrift, noe som forårsaker en mindre effekt på bioinkens fysisk-kjemiske egenskaper og presenterer stor tiltrekning for bioaktive materialer. Ved hjelp av AVIFJ-metoden ble mikrokarrierer av flere biomaterialer med diametre på 100-300 μm vellykket dannet. Dessuten ble mikrokarrierene ytterligere bevist å binde celler godt og gi et passende vekstmiljø for fulgte celler.

Protocol

1. Cellekultur Supplere høyglukose Dulbecco modifisert Minimum Essential Medium (H-DMEM) med 10% foster bovint serum (FBS), 1% unødvendig aminosyre løsning (NEAA), 1% penicillin G og streptomycin, og 1% Glutamine supplement som kulturmedier for A549 celler. Kultur A549 celler i en CO2 inkubator ved 37 °C og med 5 % CO2 Dissosiere celler for subkultur ved hjelp av trypsin ved ca. 80% samløp. Bruk 3 ml trypsin til å behandle cellene i T75-kulturflasken ved …

Representative Results

Skrivehoder med varierte konvergenshastigheter og diametre ble fremstilt for å oppnå utskrift av flere typer materialer. Dysene oppnådd med økende trekkstyrke er vist i figur 1B. Dysene ble delt inn i tre områder: reservoar (III), sammentrekning (II) og skrivehode (I). Reservoaret var den ubehandlede delen av dysen, der væsken ga statisk trykk og bioinkinngang for utskrift. Sammentrekningsområdet var hoveddelen for å generere nedadgående drivkrefter. Trekkstyrken hadde en betydelig …

Discussion

Protokollen som er beskrevet her, gir instruksjoner for fremstilling av flere typer hydrogelmikrokarrierer og etterfølgende cellesåing. Sammenlignet med mikrofluidisk brikke- og blekkskrivermetoder, gir AVIFJ-tilnærming til konstruksjon av mikrokarrierer større fleksibilitet og biokompatibilitet. En uavhengig dyse gjør det mulig å bruke et bredt spekter av lette dyser, inkludert mikropipetter i glass, i disse utskriftssystemene. Den svært kontrollerbare behandlingen gjør det mulig å justere parametere, inkludert…

Materials

A549 cells	ATCC	CCL-185	Human non-small cell lung cancer cell line
Bright field microscope	Olympus	DP70
Confocal microscope	Nikon	TI-FL
Fetal bovine serum, FBS	BI	04-001-1ACS
Gelatin	SIGMA	G1890
Glass micropipettes	sutter instrument	b150-110-10
GlutaMAX	GIBCO	35050-061
H-DMEM	GIBCO	11960-044	Dulbecco's modified eagle medium
Horseradish peroxidase powder	SIGMA	P6782
Hydrophobic agent	3M	PN7026	Follow the manufacturer's instructions and use after dilution
Micro-forge device	narishige	MF-900
Non-essential amino acids, NEAA	GIBCO	11140-050	non-essential amino acids
Penicillin G and streptomycin	GIBCO	15140-122
Petri dish	SIGMA	P5731-500EA
Puller	sutter instrument	P-1000
Sodium alginate	SIGMA	A0682
Trypsin	GIBCO	25200-056
Type I collagen solution from rat tail	SIGMA	C3867