I denne protokol beskrives en in vitro-dyrkningsmetode og funktionel analysemetode for muskelstamceller, som bevarer de fleste af deres interaktioner med deres endogene niche.
Voksen skeletmuskulaturvæv har en stamcellepopulation, der er uundværlig for sin evne til at regenerere. Ved muskelskader forlader muskelstamceller deres hvilende tilstand og aktiverer det myogene program, der i sidste ende fører til reparation af beskadiget væv samtidig med genopfyldning af muskelstamcellepuljen. Forskellige faktorer påvirker muskelstamcelleaktivitet, blandt dem iboende stimuli, men også signaler fra det direkte muskelstamcellemiljø, stamcelle nichen. Isolationen og kulturen af enkelte myofibre med deres tilknyttede muskelstamceller bevarer det meste af stamcellens interaktion med dens niche og er derfor den nærmeste mulighed for at studere muskelstamcellefunktionalitet ex vivo. Her er en protokol for isolation, kultur, siRNA transinfektion og immunstaining af muskelstamceller på deres respektive myofibre fra mus EDL (extensor digitorum longus)muskler leveres. De forsøgsbetingelser, der er skitseret her, gør det muligt at undersøge og manipulere muskelstamceller ex vivo, herunder undersøgelse af myogen aktivitet uden det iboende behov for in vivo dyreforsøg.
Skeletmuskulatur hos den voksne er et postmitotisk væv, der hovedsageligt består af multinukleated myofibers, som er effektorcellerne til frivillige bevægelser. Det har en bemærkelsesværdig evne til at regenerere, en proces, der ligner embryonal myogenese og gennemgår funktionsnedsættelser i alder og sygdom1. Denne slående regenerative kapacitet af skeletmuskulatur afhænger af muskelstamceller (MuSC’er), som også kaldes satellitceller på grund af deres placering mellem sarcolemma og basal lamina af myofibers2,3. Under hvile betingelser MuSCs er quiescent og karakteriseret ved udtryk for transskription faktor Pax7 og quiescence markører såsom Sprouty14,5,6,7,8. Ved aktivering, f.eks efter skade, Forlader MuSCs den hvilende tilstand og opregulerer den myogene lovgivningsmæssige faktor MyoD9. Pax7/MyoD dobbelt positive MuSCs formerer sig og differentierer derved myogene prækursorer celler, som også ofte omtales som myoblasts. Disse myoblasts derefter yderligere differentiere sig til aflange myocytter, en proces sammenfaldende med molekylære og morfologiske ændringer, f.eks tab af Pax7 og upregulation af Myogenin udtryk10. Myocytter derefter til sidst smelte til hinanden eller til eksisterende myofibers derved reparere det beskadigede væv. Vigtigere, en lille brøkdel af muskel stamceller vender tilbage MyoD upregulation og er i stand til selv at forny11. Status for MuSC differentiering og myogen progression kan let observeres ved undersøgelse af myogene markører som Pax7, MyoD og Myogenin10.
Kulturen af enkelte myofibers med deres tilstødende MuSC’er er en glimrende metode til at undersøge MuSC-funktionalitet i en ex vivo-indstilling, da MuSCs forbliver i deres endogene niche12,13. MuSC’ernes adfærd reguleres af iboende signaler samt ydre signaler fra nichen, en specialiseret anatomisk placering bestående af komponenter i den ekstracellulære matrix (ECM) omkring MuSC’erne og myofiberen selv. For eksempel er en af de ydre tilsynsmyndigheder for MuSC quiescence Notch signalering. Her modtages signaleringssignaler af MuSCs fra både myofiber og ECM14,15,16. Desuden er MuSC-nichen vigtig for at kontrollere divisionaksen af MuSC’er og dermed regulere MuSC-dattercellernes celle skæbne17,18. Med rimelighed kan parametre som asymmetriske MuSC-divisioner, myogen progression og selvfornyelse vurderes entydigt i dette eksperimentelle setup. For eksempel kan en flercellet klynge dannes som følge af en MuSC efter en 72 timers kulturperiode, som kan undersøges for forekomsten og procentdelen af forskellige myogene populationer som selvfornyende, formerende og yderligere differentierede MuSCs8,19,20,21. MuSC’ernes differentieringstilstand kan bestemmes ved undersøgelse af pax7,myoD’s og Myogenins udtryk/samudtryk. Efter 72 timers kultur cellerne i en klynge kan diskrimineres af følgende parametre: Pax7 kun celler er selvfornyende MuSCs, mens Pax7 / MyoD dobbelt positive celler breder / aktiveret MuSCs og yderligere differentierede myogene celler er Myogenin positive22. Desuden kan MuSC-numre eller genindtræden i cellecyklussen/aktiveringen undersøges ud over myogen progression, f.eks. gennem immunofluorescencebaserede analyser baseret på de parametre, der er beskrevet ovenfor.
Her beskrives de unikke træk ved myofiberisolations- og kulturprotokollen, f.eks. bevarelsen af MuSC’s interaktion med dens niche. Mus hele EDL (extensor digitorum longus)muskler er omhyggeligt dissekeret, fordøjet af kollagen, og fysisk triturated at opnå enkelt myofibers med deres tilhørende MSC’er for yderligere kultur. Desuden afgrænses protokollen trinnene til transfect MuSCs med siRNA til funktionelle analyser af kandidatgener og på hinanden følgende immunofluorescencebaserede analyser uden nødvendigheden af transgene dyr.
Her præsenteres en metode til funktionelt at undersøge et bestemt gens rolle i MuSC’er ved hjælp af en in vitro-tilgang. Det er vigtigt, at i det system, der er beskrevet her, dyrkes MuSC’erne under forhold, der ligner in vivo-situationen så meget som muligt og bevarer de fleste af muSCs interaktioner med deres niche. Dette opnås ved dyrkning isolerede myofibers med deres tilstødende MuSCs under flydende forhold og på hinanden følgende siRNA transfection. Procedurerne for myofiberisolation, siRNA-transinfektion og undersøgelse af MuSC-populationer i løbet af 72 timers kultur gennem immunofluorescenceanalyser er beskrevet. Desuden blev det påvist, at omkring 74% af alle muSC’er blev overført med en fluorescerende mærket kontrol siRNA efter 30 timers kultur.
Særlig opmærksomhed bør være fokuseret på omhyggelig dissektion af EDL muskel, da omfattende stretching, klemme, eller klemme vil føre til sammentrækning og på hinanden følgende død myofibers. Desuden er det vigtigt at undersøge klynger af MuSCs fra mindst 20 forskellige myofibers per replikere pr betingelse. Dette er nødvendigt, da MuSC-numre og egenskaber varierer på grund af eksistensen af MuSC-delpopulationer. Ved undersøgelse af effekten af en specifik siRNA på MuSC’er ved hjælp af flydende myofiber kultur metode en sammenligning af tilstanden med målretning siRNA til ikke-målretning kontrol bør udføres inden for samme mus og muskler. Dette anbefales for at undgå musespecifikke forskelle, som kan dække eller forstærke virkningerne af siRNA’et. Knockdown-effektiviteten kan bestemmes af immunofluorescenceanalyser med antistoffer rettet mod målgenet ved hjælp af enkelte myofibre med deres tilstødende MuSC’er. Hvis dette ikke er en mulighed, kan man teste siRNA knockdown effektivitet i primære myoblasts efterfulgt af kvantitative RT-PCR eller immunoblot analyser. Effektiviteten af siRNA skal bestemmes, før siRNA’en analyseres på muSC’er på enkelte myofibre. Brugen af en smart pool bestående af 4 forskellige siRNAs versus en enkelt øger knockdown effektivitet, men øger også risikoen for uspecifik målretning. Et ikke-målretnings siRNA bør anvendes som en kontrol. For direkte at overvåge transfection effektivitet, kan man bruge en fluorescerende mærket ikke-målretning siRNA som udført her. Tidspunktet for transfektion med siRNA er omkring 4 timer efter isolation, et tidspunkt, hvor den basale lamina omkring MuSCs allerede er gennemtrængelig for siRNA. Hvis virkningen af en specifik siRNA på MuSC’er efter 72 eller 96 timer undersøges, anbefales det at udføre en anden siRNA-transfektion efter 24 timer eller 48 timer for at opretholde en høj knockdown-effektivitet.
Myofiber kultur assay viser forskellige fordele i forhold til undersøgelsen af MuSCs med konventionelle celle kultur metoder. MuSCs forbliver knyttet til myofibers under hele isolationsprocessen og bevarer derved det afgørende samspil mellem MuSC med dets niche19,23,24,25. Den bevarede interaktion mellem MuSCs med myofiber er en forudsætning for at studere nicheafhængige effekter på MuSC-funktionalitet, som ikke kan rekapituleres i konventionelle 2D myoblast kulturer. For eksempel, under aldrende MuSCs display nedsat myogen kapacitet resulterer i en reduceret effektivitet til at regenerere muskelvæv efter skader20,26. Denne nedskrivning skyldes i det mindste delvis ændringer i MuSC-nichen , navnlig ændringer i ECM-sammensætningen27,28. Myofiber kultur protokol tillader undersøgelse og indblanding i disse afvigende niche ændringer.
I modsætning til den metode, der er beskrevet her, rensning af MuSC’er ved immunmærkning og -sortering teknikker som FACS (fluorescens aktiveret celle sortering) eller MACS (magnetisk celle sortering) indebærer fjernelse af MuSC’er fra deres niche. Interessant nok mister 2D-kulturer af isolerede muSCs fra alderen muskler deres ydre signaler og opfører sig svarende til MuSCs isoleret fra unge muskler og derved ikke recapitulating in vivo situationen passende29. Desuden resulterer den fuldstændige dissociation af muskelvævet og mærkningen af muSC’er med overflademarkører i transskriptomiske ændringer og aktivering af cellerne30,31,32. En anden fordel ved myofiberkultursystemet er muligheden for at forstyrre MuSC-funktionaliteten på forskellige niveauer. Manipulation af MuSCs på dyrkede myofibre kan effektivt opnås ved siRNA-medieret gen knockdown som beskrevet her i detaljer. Ligeledes er anvendelsen af kemiske forbindelser eller levering af rekombinante proteiner meget effektiv til at forstyrre stamcelleveje20,28. Desuden tillader retro- eller lentiviral ekspressionsvektorer indførelsen af udefrakommende gener,dvs. Derudover kan påvirkningen af ydre faktorer på MuSC-funktionalitet udforskes i det system, der er beskrevet her, f.eks. kan kulturforholdene suppleres med supernatant fra forskellige fysiologiske eller patologiske kilder for at modellere forskellige tilstande som kræftkaksi34,35.
En begrænsning af den metode, der er beskrevet her, er det faktum, at det enkelte myofiberkultursystem ikke helt kan generobre virkningen af alle systemiske faktorer eller indflydelse af andre celletyper på MuSCs. Også den tid, hvor myofibers kan holdes levedygtige i kulturen er begrænset, og derfor studiet af MuSC relaterede processer fokuserer på tidlige begivenheder som aktivering og myogen engagement. Desuden er undersøgelsen af MuSC interaktion med andre nicheceller såsom immunceller eller fibro-adipogenic stamfader celler ikke muligt. For at undersøge systemiske virkninger på MuSC funktionalitet kan man enten udføre muskelskade eksperimenter efterfulgt af analyse af muskel regenerering in vivo eller udføre transplantation eksperimenter36,37.
Samlet set giver myofiberisolations- og kulturprotokollen stor mulighed for genetiske eller mekanistiske undersøgelser af voksne MuSC’er uden krav om transgene musemodeller og kan potentielt reducere dyreforsøg.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Christine Poser og Christina Picker for fremragende teknisk assistance og kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft til JvM (MA-3975/2-1), Carl Zeiss-fonden og Deutsche Krebshilfe (DKH-JvM-861005).
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG 2b | ThermoScientific | A-21141 | use 1:1000 for IF |
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | ThermoScientific | A-21123 | use 1:1000 for IF |
chicken embryo extract | Seralab | CE-650-J | chicken embryo extract containing growth factors etc. |
collagenase type 1 | Sigma | C0130 | |
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5 g/l glucose and sodium pyruvate) | GibCo | 41966029 | cell culture medium |
fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | fetal bovine serum |
horse serum | Gibco | 26050-088 | |
Lipofectamine RNAiMax | ThermoScientific | 13778150 | transfection reagent |
MyoD antibody clone G-1 | Santa Cruz | sc-377460 | dilute 1:200 for IF |
Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | use undiluted |
siGLO Red Transfection Indicator | horizon discovery | D-001630-02-05 | non targeting siRNA |