Fragmentbaserad screening med NMR är en robust metod för att snabbt identifiera småmolekylära bindemedel till biomakromolekyler (DNA, RNA eller proteiner). Protokoll som beskriver automationsbaserad provberedning, NMR-experiment & förvärvsförhållanden och analysarbetsflöden presenteras. Tekniken möjliggör optimalt utnyttjande av både 1H och 19F NMR-aktiva kärnor för detektion.
Fragmentbaserad screening (FBS) är ett väl validerat och accepterat koncept inom läkemedelsupptäcktsprocessen både inom akademin och industrin. Den största fördelen med NMR-baserad fragmentscreening är dess förmåga att inte bara detektera bindemedel över 7-8 storleksordningar av affinitet utan också att övervaka renhet och kemisk kvalitet hos fragmenten och därmed producera högkvalitativa träffar och minimala falska positiva eller falska negativ. En förutsättning inom FBS är att utföra initial och periodisk kvalitetskontroll av fragmentbiblioteket, bestämma löslighet och kemisk integritet hos fragmenten i relevanta buffertar och upprätta flera bibliotek för att täcka olika byggnadsställningar för att rymma olika makromolekylmålklasser (proteiner / RNA / DNA). Vidare krävs en omfattande NMR-baserad screeningprotokolloptimering med avseende på provkvantiteter, förvärvshastighet och analys på nivå med biologisk konstruktion / fragmentrum, i tillståndsrum (buffert, tillsatser, joner, pH och temperatur) och i ligandrum (ligandanaloger, ligandkoncentration). Åtminstone inom akademin har dessa screeninginsatser hittills genomförts manuellt på ett mycket begränsat sätt, vilket leder till begränsad tillgång till screeninginfrastruktur, inte bara i läkemedelsutvecklingsprocessen utan också i samband med utveckling av kemisk sond. För att möta kraven ekonomiskt presenteras avancerade arbetsflöden. De drar nytta av den senaste toppmoderna avancerade hårdvaran, med vilken vätskeprovuppsamlingen kan fyllas på ett temperaturkontrollerat sätt i NMR-rören på ett automatiserat sätt. 1H/19F NMR-ligandbaserade spektra samlas sedan in vid en given temperatur. Provväxlare med hög genomströmning (HT-provväxlare) kan hantera mer än 500 prover i temperaturkontrollerade block. Detta tillsammans med avancerade mjukvaruverktyg påskyndar datainsamling och analys. Vidare beskrivs tillämpning av screeningrutiner på protein- och RNA-prover för att göra medvetna om de etablerade protokollen för en bred användarbas inom biomakromolekylär forskning.
Fragmentbaserad screening är nu en vanlig metod för att identifiera ganska enkla och lågmolekylära molekyler (MW <250 Da) som visar svag bindning till makromolekylära mål inklusive proteiner, DNA och RNA. Initiala träffar från primära skärmar tjänar som grund för att genomföra en sekundär skärm av kommersiellt tillgängliga större analoger av träffarna och sedan använda kemibaserade fragmenttillväxt eller länkningsstrategier. För en framgångsrik fragmentbaserad drug discovery (FBDD) plattform krävs i allmänhet en robust biofysisk metod för att upptäcka och karakterisera svaga träffar, ett fragmentbibliotek, ett biomolekylärt mål och en strategi för uppföljningskemi. Fyra vanligt förekommande biofysiska metoder inom läkemedelsupptäcktskampanjerna är termiska skiftanalyser, ytplasmonresonans (SPR), kristallografi och kärnmagnetisk resonansspektroskopi (NMR).
NMR-spektroskopi har visat varierande roller inom FBDS olika stadier. Förutom att säkerställa den kemiska renheten och lösligheten hos fragmenten i ett fragmentbibliotek upplöst i ett optimerat buffertsystem, kan ligandobserverade NMR-experiment detektera fragmentbindning till ett mål med låg affinitet och de målobserverade NMR-experimenten kan avgränsa fragmentets bindningsepitop, vilket möjliggör detaljerade struktur-aktivitetsrelationsstudier. Inom epitopkartläggning kan NMR-baserade kemiska skiftförändringar inte bara identifiera de ortosteriska bindningsställena utan även allosteriska platser som kan vara kryptiska och endast tillgängliga i så kallade exciterade konformationstillstånd hos det biomolekylära målet. Om det biomolekylära målet redan binder en endogen ligand kan de identifierade fragmentträffarna enkelt klassificeras som allosteriska eller ortosteriska genom att utföra NMR-baserade tävlingsexperiment. Att bestämma dissociationskonstanten (KD) för ligand-målinteraktionen är en viktig aspekt i FBDD-processen. NMR-baserade kemiska skifttitreringar, antingen ligand eller mål observerade kan lätt utföras för att bestämma KD. En stor fördel med NMR är att interaktionsstudierna utförs i lösning och nära fysiologiska förhållanden. Således kan alla konformationstillstånd för analys av ligand/fragmentinteraktion med dess mål undersökas. Vidare är NMR-baserade tillvägagångssätt inte bara begränsade till screening av välveckade lösliga proteiner, utan tillämpas också för att rymma större målutrymme inklusive DNA, RNA, membranbundna och inneboende oordnade proteiner1.
Fragmentbibliotek är en oumbärlig del av FBDD-processen. I allmänhet fungerar fragment som de initiala prekursorerna som så småningom blir en del (understruktur) av den nya hämmaren som utvecklats för ett biologiskt mål. Flera läkemedel (Venetoklax2, Vemurafenib3, Erdafitinib4, Pexidartnib5) har rapporterats ha börjat som fragment och används nu framgångsrikt i klinikerna. Vanligtvis är fragment organiska molekyler med låg molekylvikt (<250 Da) med hög vattenlöslighet och stabilitet. Ett noggrant utformat fragmentbibliotek som vanligtvis innehåller några hundra fragment kan redan lova effektiv utforskning av kemiskt utrymme. Den allmänna sammansättningen av fragmentbibliotek har utvecklats över tid och oftast härletts genom att dissekera kända läkemedel i mindre fragment eller designats beräkningsmässigt. Dessa olika fragmentbibliotek innehåller huvudsakligen platta aromatiska eller heteroatomer och följer Lipinski-regeln 5 6, eller den nuvarande kommersiella trendregeln 3 7, men undviker reaktiva grupper. Vissa fragmentbibliotek härleddes också eller bestod av mycket lösliga metaboliter, naturliga produkter och/eller deras derivat8. En allmän utmaning som de flesta fragmentbiblioteken utgör är enkel nedströmskemi.
Center for Biomolecular Magnetic Resonance (BMRZ) vid Goethe-Universität Frankfurt är partner till iNEXT-Discovery (Infrastructure for NMR, EM and X-rays for Translational research-Discovery), ett konsortium för strukturella forskningsinfrastrukturer för alla europeiska forskare från alla områden av biokemisk och biomedicinsk forskning. Inom det tidigare initiativet iNEXT som avslutades 2019 skapades ett fragmentbibliotek bestående av 768 fragment i syfte att “minimala fragment och maximal mångfald” som täcker ett stort kemiskt utrymme. Vidare, till skillnad från alla andra fragmentbibliotek, utformades iNEXT-fragmentbiblioteket också baserat på begreppet “poised fragments” i syfte att underlätta nedströms syntes av komplexa, högaffinitetsligander och hädanefter känt som internt bibliotek (Diamond, Structural Genomic Consortium och iNEXT).
Att etablera FBDD av NMR kräver arbetskraft, kunskap och instrumentering. Vid BMRZ har optimerade arbetsflöden för att stödja tekniskt stöd till fragmentscreening med NMR utvecklats. Dessa inkluderar kvalitetskontroll och löslighetsbedömning av fragmentbiblioteket 9, buffertoptimering för de valda målen, 1H eller 19F-observerad 1D-ligandbaserad screening, tävlingsexperiment för att skilja mellan ortosterisk och allosterisk bindning, 2D-baserade målobserverade NMR-experiment för epitopkartläggning och för att karakterisera interaktionen med sekundär uppsättning derivat av de initiala fragmentträffarna. BMRZ har etablerat automatiserade rutiner för analys, som också tidigare diskuterats i litteratur 10,11, av småmolekyl-proteininteraktioner och har på plats all nödvändig automatiserad infrastruktur för NMR-baserad fragmentscreening. Det har implementerat mättnadsöverföringsskillnad NMR (STD-NMR), vattenligand observerad via gradientspektroskopi (waterLOGSY) och Carr-Purcell-Meiboom-Gill-baserade (CPMG-baserade) avslappningsexperiment för att identifiera fragment inom ett brett spektrum av affinitetsregimer samt toppmodern automatiserad NMR-instrumentering och programvara för läkemedelsupptäckt. Medan NMR-baserad fragmentscreening är väl etablerad för proteiner, används detta tillvägagångssätt mindre vanligt för att hitta nya ligander som interagerar med RNA och DNA. BMRZ har etablerat proof of concept för nya protokoll som möjliggör identifiering av små molekyl-RNA/DNA-interaktioner. I följande avsnitt av detta bidrag rapporteras tillämpning av screeningrutiner på protein- och RNA-prover för att göra medvetna om de etablerade protokollen för en bred användarbas inom biomakromolekylär forskning.
Mångsidighet av NMR-baserad fragment / läkemedelsscreening. BMRZ har framgångsrikt implementerat toppmodern automatiserad NMR-instrumentering samt STD-NMR, waterLOGSY och avslappningsexperiment för att identifiera fragment inom ett brett spektrum av affinitetsregimer för läkemedelsupptäckt. Den installerade hårdvaran inkluderar en provberedningsrobot med hög genomströmning och provlagrings-, växlar- och datainsamlingsenhet med hög genomströmning associerad med en 600 MHz-spektrometer. En nyligen inköpt kryogen sond för 1 H, 19 F, 13 C och 15N säkerställer den nödvändiga känsligheten för de föreslagna mätningarna och möjliggör 1 H (1) frikoppling under 19F-detektering. Denna prob är kopplad till den senaste generationen NMR-konsol som erbjuder möjligheten att använda de avancerade mjukvaruverktygen från Bruker, inklusive CMC-q, CMC-assist, CMC-se och FBS (ingår i TopSpin). Det fragmentbaserade screeningverktyget (FBS) ingår i den senaste versionen av TopSpin och hjälper till att analysera data med hög genomströmning bestående av STD, waterLOGSY, T2/T1 r-relaxeringsexperiment. Den flytande 1D 1H-provinsamlingen kan fyllas i NMR-rören på ett automatiserat sätt med hjälp av provfyllningsroboten. Vanligtvis fylls ett block med 96 rör (3 mm) på cirka två timmar. Plattrackarna med 96 brunnar är direkt placerade i HT-provväxlaren, som läser av blockets streckkod och tilldelar NMR-rören till experimenten som styrs av automatiseringsprogramvaran (IconNMR). Fem 96-brunnsställ kan lagras och programmeras i HT-provväxlaren samtidigt. Temperaturen på var och en av de enskilda racken kan styras och regleras separat. Dessutom kan varje enskilt prov förkonditioneras (förvärmning och rörtorkning för avlägsnande av kondenserad fuktighet) till önskad temperatur före mätningen.
Lämplighet för ett brett spektrum av applikationer. En av de breda tillämpningarna av denna automatiserade NMR-baserade screening är att identifiera och utveckla nya ligander som binder till ett biomakromolekylärt mål (DNA / RNA / proteiner). Dessa ligander kan inkludera ortosteriska och allosteriska hämmare som vanligtvis binder icke-kovalent. Vidare används FBDD av NMR vanligtvis som ett första steg för att välja lovande föreningar, kraven som ska uppfyllas är tillgängligheten av det biomolekylära målet i tillräckliga mängder. Detta mål är uppdelat i två huvuduppgifter.
Uppgift ett är att utveckla och karakterisera ett internt fragmentbibliotek av följande skäl: initial och periodisk kvalitetskontroll, karakterisering och kvantifiering av mer än 1000 fragment; Bestämning av lösligheten hos fragmenten i buffertar optimerade för varje mål, särskilt för proteinmål. och inrättandet av flera bibliotek för att rymma olika byggnadsställningar och sträcka sig mot andra makromolekylklasser. Uppgift två är att integrera arbetsflöden för fragmentbaserad läkemedelsdesign (FBDD) genom NMR med: automatiserad 1D-ligandobserverad screening (1H och 19F observerade); automatiserade ersättningsanalyser (tävlingsexperiment med (naturlig) ligand) för att differentiera ortosterisk och allosterisk bindning; automatiserade sekundära screeningar med flera fragment; Automatiserad 2D-proteinscreening och sekundär screening av en uppsättning derivat kring en första träff med hjälp av EU-OPENSCREEN-biblioteket eller något annat bibliotek. och omprofilering av screening av FDA-biblioteket mot de valda målen.
Dessutom kan metabotypning av olika cellinjer (sjukdomsrelevant) utföras för att avslöja de reglerande mekanismerna som länkar cellcykelkontroll och metabolism. Det finns också funktionell karakterisering av RNA / DNA / proteinregleringselement in vivo och in vitro för optimering av konstruktion / domänoptimering (stabilitetsoptimering för strukturella undersökningar (buffert-, pH-, temperatur- och saltscreening) och en utvidgning av NMR-baserad fragmentscreening till membranproteiner och inneboende oordnade proteiner, som i allmänhet är otillgängliga för andra tekniker.
Begränsningar. Användning av 19F- och 1H-fragmentbibliotek har sina fördelar och nackdelar, varav få kommer att nämnas i det följande. Den största fördelen med 19F kontra 1H-mätningar är hastigheten på både den faktiska mättiden och den efterföljande analysen, eftersom blandningarna innehåller nästan dubbelt så många fragment och färre experiment måste utföras. Uppföljningsanalysen är också enklare för 19F-screening, eftersom det inte finns någon störning från buffertar och dessutom erbjuder ett bredare kemiskt skiftområde med nästan ingen signalöverlappning för en optimalt utformad fragmentblandning. Spektra själva är mycket förenklade, vanligtvis har de bara en eller två signaler per fragment, beroende på antalet fluoratomer. Analysen av dessa spektra kan därför automatiseras, vilket återigen minskar tiden. Detta sker på bekostnad av kemisk mångfald, åtminstone för biblioteket som används i denna studie. Eftersom endast ~ 13% av biblioteket innehåller 19F, men naturligtvis alla är användbara vid 1H-screening, kommer mångfalden av 19F-screeningfragmenten att vara lägre. Detta kan kringgås med hjälp av specialdesignade 19F-bibliotek med fler fragment och större kemisk mångfald. En annan nackdel för 19F-screening är det låga antalet signaler per fragment. Fragment består i allmänhet av mer än en väteatom. Därför kan 1H observerade screeningexperiment förlita sig på olika signaler för samma fragment för detektering av bindning. Detta ger en högre grad av förtroende vid identifiering av träffar för 1H-screening, medan 19F-screening måste förlita sig på en eller två signaler som ges per fragment.
En detaljerad redogörelse för den moderna automatiserade NMR-baserade fragmentscreeninginstrumentationen, programvara och analysmetoder och protokoll därav har presenterats. Den installerade hårdvaran inkluderar en provberedningsrobot med hög genomströmning och en provlagrings-, växlar- och datainsamlingsenhet med hög genomströmning associerad med en 600 MHz-spektrometer. Ett nyligen installerat kryogent sondhuvud för 1 H, 19 F, 13 C och 15N säkerställer den känslighet som krävs för de föreslagna mätningarna och möjliggör 1H frikoppling under 19F-detektering. Dessutom erbjuder den senaste generationen av NMR-konsolen möjligheten att använda avancerad analytisk programvara för att underlätta förvärv och on-the-fly-analys. Den ovan diskuterade tekniken, arbetsflödena och de beskrivna protokollen bör främja anmärkningsvärd framgång för användare som bedriver FBS av NMR.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har fått stöd av iNEXT-Discovery, projekt nummer 871037, finansierat av Europeiska kommissionens Horizon 2020-program.
Bruker Avance III HD | Bruker | 600 MHz NMR Spectrometer | |
Matrix Clear Polypropylene 2D Barcoded Open-Top Storage Tubes | 3731-11 0.75ML V-BOTTOM TUBE/LATCH RACK | ThermoFisher Scientific | Barcoded Tubes |
Matrix SepraSeal und DuraSeal& | 4463 Cap Mat, SeptraSeal 10/CS | ThermoFisher Scientific | |
SampleJet | Bruker | HT Sample Changer | |
SamplePro Tube | Bruker | Pipetting Robot |