केंद्रीय तंत्रिका तंत्र मेटास्टेसिस पीडीएक्स मॉडल मानव मेटास्टेसिस के फेनोटाइपिक और आणविक विशेषताओं का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिससे उन्हें प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के लिए उत्कृष्ट मॉडल बनाया जाता है। यहां वर्णित है कि पीडीएक्स मॉडल और टीकाकरण मार्गों को कैसे स्थापित किया जाए जो प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के लिए सबसे अच्छा उपयोग किया जाता है।
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) मेटास्टेसिस के लिए नए उपचारों के विकास को प्रीक्लिनिकल मॉडल की कमी से बाधित किया गया है जो रोग का सटीक प्रतिनिधित्व करते हैं। सीएनएस मेटास्टेसिस के रोगी व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट (पीडीएक्स) मॉडल को मानव रोग के फेनोटाइपिक और आणविक विशेषताओं का बेहतर प्रतिनिधित्व करने के लिए दिखाया गया है, साथ ही ऐतिहासिक सेल लाइन मॉडल की तुलना में मानव रोगी ट्यूमर की विषमता और क्लोनल गतिशीलता को बेहतर ढंग से प्रतिबिंबित किया गया है। कई साइटें हैं जिनका उपयोग प्रीक्लिनिकल परीक्षणों की स्थापना करते समय रोगी-व्युत्पन्न ऊतक को प्रत्यारोपित करने के लिए किया जा सकता है, प्रत्येक के अपने फायदे और नुकसान हैं, और प्रत्येक मेटास्टैटिक कैस्केड के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है। यहां, प्रोटोकॉल बताता है कि पीडीएक्स मॉडल कैसे स्थापित करें और पूर्व-नैदानिक अध्ययनों में सीएनएस मेटास्टेसिस पीडीएक्स मॉडल का उपयोग करने के लिए तीन अलग-अलग दृष्टिकोण प्रस्तुत करें, उनके प्रत्येक अनुप्रयोगों और सीमाओं पर चर्चा करें। इनमें फ्लैंक आरोपण, मस्तिष्क में ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन और इंट्राकार्डियक इंजेक्शन शामिल हैं। चमड़े के नीचे फ्लैंक आरोपण निगरानी करना सबसे आसान है और इसलिए, पूर्व-नैदानिक अध्ययनों के लिए सबसे सुविधाजनक है। इसके अलावा, फ्लैंक आरोपण से मस्तिष्क और अन्य ऊतकों में मेटास्टेस देखा गया था, यह दर्शाता है कि ट्यूमर मेटास्टेसिस के कई चरणों से गुजरा है, जिसमें इंट्रावासेशन, एक्स्ट्रावेसन और उपनिवेशीकरण शामिल हैं। मस्तिष्क में ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन मस्तिष्क ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को पुन: उत्पन्न करने के लिए सबसे अच्छा विकल्प है और रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) को पार करने के लिए जीवविज्ञान की प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए उपयोगी है लेकिन मेटास्टैटिक कैस्केड के अधिकांश चरणों को बाईपास करता है। इंट्राकार्डियक इंजेक्शन मस्तिष्क को मेटास्टेसिस की सुविधा देता है और अंग ट्रोपिज्म का अध्ययन करने के लिए भी उपयोगी है। जबकि यह विधि मेटास्टैटिक कैस्केड के पहले चरणों को छोड़ देती है, इन कोशिकाओं को अभी भी परिसंचरण, अतिरिक्त और उपनिवेश से बचना होगा। पीडीएक्स मॉडल की उपयोगिता, इसलिए, ट्यूमर टीकाकरण के मार्ग से प्रभावित होती है और किसका उपयोग करना है, इसका विकल्प वैज्ञानिक प्रश्न और प्रयोग के समग्र लक्ष्यों द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए।
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में मेटास्टेसिस की घटना हाल के वर्षों में 1,2,3 में बढ़ी है। सीएनएस मेटास्टेसिस के लिए पारंपरिक उपचार, जैसे कि ट्यूमर रिसेक्शन, पूरे मस्तिष्क रेडियोथेरेपी और स्टीरियोटैक्टिक रेडियोसर्जरी, काफी हद तक उपशामक और शायद ही कभी उपचारात्मक रहे हैं, और इससे दुर्बल दुष्प्रभाव हो सकते हैं, जैसे कि संज्ञानात्मक गिरावट1। हाल ही में, सीएनएस मेटास्टेसिस के उपचार के लिए कई नए लक्षित और प्रतिरक्षात्मक उपचार विकसित किए जा रहे हैं जो कम दुष्प्रभाव होने के साथ-साथ अधिक प्रभावी उपचार होने का वादा दिखातेहैं।
प्रीक्लिनिकल परिणामों को सार्थक नैदानिक समापन बिंदुओं में अनुवाद करने के लिए अक्सर प्रभावी और पूर्वानुमानित मॉडलिंग रणनीतियों की आवश्यकता होती है। ऐतिहासिक रूप से, सेल लाइन जेनोग्राफ्ट मॉडल सीएनएस मेटास्टेसिस अनुसंधान में प्रीक्लिनिकल अनुसंधान के लिए मानक थे। हालांकि, ये सेल लाइन मॉडल मेजबान ट्यूमर के सच्चे ट्यूमर व्यवहार को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं या रोग के हिस्टोलॉजिकल या आणविक विषमता का प्रतिनिधित्व करते हैं। इसके अलावा, सेल लाइन मॉडल इन विट्रो विकास स्थितियों के अनुकूल होने में सक्षम हैं और इसलिए, मेजबान ट्यूमर के मूल गुणों को खो देते हैं। रोगी व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स (पीडीएक्स), जो एक रोगी के ट्यूमर को एक इम्यूनोडेफिशिएंट या मानवकृत माउस में संलग्न करते हैं, ट्रांसलेशनल कैंसर अनुसंधान में तेजी से उपयोग किए जाते हैं। शोधकर्ताओं ने दिखाया है कि पीडीएक्स मॉडल आमतौर पर ट्यूमर के विकास, हिस्टोलॉजिकल विशेषताओं को ईमानदारी से पुन: उत्पन्न कर सकते हैं, ट्यूमर विषमता, मेटास्टैटिक क्षमता और आणविक आनुवंशिक विशेषताओं को बनाए रख सकते हैं। इसके अलावा, पीडीएक्स मॉडल रोगसूचक हैं जिससे पीडीएक्स ट्यूमर विलंबता अवधि रोगी के समग्र अस्तित्व के साथ संबंधित है और उन्हें रोगी परीक्षणों में चिकित्सीय प्रतिक्रिया की सटीक भविष्यवाणी करने के लिए भी दिखाया गया है 5,6.
ज्यादातर, ये एक ही मूल से उत्पन्न ट्यूमर का प्रतिनिधित्व करने वाले विकसित किए गए हैं, जैसे कि गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (एनएससीएलसी)7, स्तन कैंसर 8,9, और मेलेनोमा 10,11। हाल ही में, पीडीएक्स मॉडल का एक बड़ा और विविध संग्रह विकसित और विशेषता है, जो आठ अलग-अलग हिस्टोलॉजिकल उपप्रकारोंका प्रतिनिधित्व करता है। यह प्रदर्शित किया गया है कि सीएनएस मेटास्टेसिस के लिए पीडीएक्स मॉडल उनके मूल रोगी ट्यूमर से निकटता से मिलते जुलते हैं, दोनों हिस्टोलॉजिकल और आणविक रूप से और हिस्टोलॉजिकल अद्वितीय अंतर और समानताएं10,12 भी प्रदर्शित की हैं। इसके अलावा, जबकि अधिकांश सीएनएस मेटास्टेसिस पीडीएक्स मॉडल मानव ट्यूमर की क्लोनल विषमता को बनाए रखते हैं, कुछ ने क्लोनल उत्तराधिकार12 के सबूत प्रदर्शित किए, जिससे उन्हें उपचार के बाद क्लोनल परिवर्तनों की निगरानी करके उपचारों के प्रतिरोध का अध्ययन करने के लिए भी आदर्श बनाया गया।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल पीडीएक्स स्थापना के तरीकों और सीएनएस मेटास्टेसिस के प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में उपयोग किए जाने वाले टीकाकरण के विभिन्न मार्गों को रेखांकित करते हैं (चित्रा 1)। ये आरोपण विधियां विकास और मेटास्टेसिस की नकल करने की उनकी क्षमता में भिन्न होती हैं। यहां, प्रोटोकॉल आरोपण के प्रत्येक मार्ग के लिए अनुप्रयोगों पर प्रकाश डालता है और दर्शाता है कि सीएनएस मेटास्टेसिस के अध्ययन के लिए उनका उपयोग कैसे किया जा सकता है।
वर्तमान पांडुलिपि में, पीडीएक्स स्थापना और प्रसार के तरीकों का विस्तृत विवरण दिया गया है। सीएनएस मेटास्टेसिस का मूल्यांकन करते समय प्रीक्लिनिकल अध्ययन स्थापित करने के लिए उपयोग किए जा सकने वाले तीन अलग-अलग टीकाकरण विधियों का भी प्रदर्शन किया गया है। पसंद की विधि प्रयोग के लक्ष्यों पर निर्भर होनी चाहिए। कुछ मामलों में, एक से अधिक टीकाकरण मार्ग का उपयोग करना फायदेमंद होगा। उदाहरण के लिए, चमड़े के नीचे फ्लैंक आरोपण ट्यूमर के विकास पर दवा की प्रभावशीलता का अध्ययन करने और अपने लक्ष्य पर दवा का आकलन करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण प्रदान करता है और यह ट्यूमर के आकार के लिए एक दृश्य भी प्रदान करता है जिसे आसानी से निगरानी और मापा जाता है। हालांकि, एक बार लक्ष्य व्यवहार्यता और एंटी-ट्यूमर विकास गुण स्थापित हो जाने के बाद, बीबीबी को पार करने और मस्तिष्क ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर इसके प्रभाव का अध्ययन करने के लिए जीवविज्ञान की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए एक ऑर्थोटोपिक अध्ययन स्थापित किया जा सकता है। इसके अलावा, ऑर्थोटोपिक और इंट्राकार्डियक इंजेक्शन अध्ययनों में उत्तरजीविता का बेहतर मूल्यांकन किया जाता है।
मस्तिष्क मेटास्टेसिस पीडीएक्स मॉडल का इंट्राक्रैनील इंजेक्शन अक्सर मस्तिष्क माइक्रोएन्वायरमेंट और बीबीबी की उपस्थिति के कारण पसंद का प्रीक्लिनिकल मॉडल होता है। हालांकि, अध्ययनों से पता चला है कि मस्तिष्क मेटास्टेस में बीबीबी को संशोधित करने की क्षमता होती है, जो ट्यूमर16 के अणुओं की पारगम्यता को प्रभावित करती है। बीबीबी में ये परिवर्तन इंट्राक्रैनील रूप से प्रत्यारोपित ट्यूमर द्वारा परिलक्षित नहीं होंगे, और इस वजह से प्रीक्लिनिकल दवा अध्ययन रोगी ट्यूमर की प्रतिक्रिया को पूरी तरह से प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं। इस चेतावनी के साथ भी, इंट्राक्रैनील इंजेक्शन प्रीक्लिनिकल मॉडल में बीबीबी को पार करने के लिए दवाओं की पारगम्यता और प्रभावकारिता का परीक्षण करने का सबसे अच्छा तरीका बना हुआ है। इंट्राक्रैनील मॉडल के साथ एक और चुनौती यह है कि वे ट्यूमर के विकास की निगरानी के लिए मुश्किल हैं और इमेजिंग तकनीकों के उपयोग की आवश्यकता होती है। फ्लोरोसेंट या बायोल्यूमिनेसेंट मार्करों के साथ पीडीएक्स का वायरल ट्रांसडक्शन पारंपरिक रूप से उपयोग किया जाता है लेकिन प्रदर्शन करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। हालांकि, चूहों में उपयोग के लिए कई इमेजिंग तकनीकविकसित की जा रही हैं जिन्हें मार्करों की शुरूआत की आवश्यकता नहीं है, जो प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के लिए इन ऑर्थोटोपिक ब्रेन ट्यूमर की निगरानी में आसानी में सुधार कर सकते हैं। इनमें चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) और पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) इमेजिंग और माइक्रो कंप्यूटेड टोमोग्राफी (माइक्रो-सीटी) जैसी इमेजिंग प्रौद्योगिकियां शामिल हैं। अंत में, इंट्राक्रैनील इंजेक्शन मस्तिष्क के बाहर सीएनएस मेटास्टेस के माइक्रोएन्वायरमेंट को सटीक रूप से प्रतिबिंबित नहीं कर सकता है, जैसे कि लेप्टोमेनिंगल मेटास्टेसिस में। इस मामले में, सिस्टर्ना मैग्ना में इंजेक्शन लेप्टोमेनिंगियल मेटास्टेस17 का अधिक सटीक प्रतिनिधित्व करने के लिए किया जा सकता है।
पीडीएक्स मॉडल के फेनोटाइपिक और आणविक विशेषताओं दोनों का लक्षण वर्णन प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के लिए सर्वोत्तम मॉडल का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है। ट्यूमर विलंबता 7-140 दिनों तक हो सकती है और लेने की दर भी अत्यधिक परिवर्तनशीलहो सकती है। प्रत्यारोपण के लिए जानवरों की इष्टतम संख्या और उपचार शुरू करने का समय प्रत्येक पीडीएक्स मॉडल की विशेषताओं पर आधारित होना चाहिए और इसे अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करने की आवश्यकता है। इसके अलावा, पीडीएक्स ट्यूमर की आणविक प्रोफ़ाइल प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के लिए सबसे अधिक प्रतिनिधि पीडीएक्स मॉडल के चयन के लिए भी महत्वपूर्ण है। मॉडल आणविक रूप से दाता ऊतक का प्रतिनिधित्व करता है, नैदानिक प्रतिक्रिया का अधिक पूर्वानुमान होने की संभावना है। इसके अलावा, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि मानव डेटा से चुने गए लक्ष्य अध्ययन के लिए चुने जा रहे पीडीएक्स में मौजूद हैं और कुछ पीढ़ियों के माध्यम से बनाए रखे जाते हैं, जैसा कि दिखाया गया है कि क्लोनल उत्तराधिकार मौजूदा प्रमुख क्लोन के एक अलग जीनोमिक प्रोफाइल से जुड़ा हुआ है। इसके प्रकाश में, सीएनएस मेटास्टेसिस पीडीएक्स ट्यूमर के फेनोटाइपिक और आणविक प्रोफाइल को कई पीढ़ियों में बड़े पैमाने परचित्रित किया गया है।
सीएनएस मेटास्टेसिस पीडीएक्स मॉडल का उपयोग करने के कई फायदों के बावजूद, उनके उपयोग से संबंधित कई सीमाएं हैं। सबसे पहले, एक वैकल्पिक ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट और विशेष रूप से प्रतिरक्षा प्रणाली की कमी पीडीएक्स मॉडल18 की अच्छी तरह से प्रलेखित सीमाएं हैं। चूहों में मानव ट्यूमर के जेनोग्राफ्ट के परिणामस्वरूप प्रत्येक बाद के मार्ग के साथ माउस स्ट्रोमा के साथ मानव स्ट्रोमा का प्रतिस्थापन होता है और मानव स्ट्रोमा को आम तौर पर कईमार्गों के बाद पूरी तरह से बदल दिया जाता है। हालांकि, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में अंतर के परिणामस्वरूप मूल रोगी ट्यूमर12 की तुलना में फ्लैंक-प्रत्यारोपित पीडीएक्स ट्यूमर के आणविक प्रोफ़ाइल में बड़े अंतर नहीं होते हैं, यह सुझाव देते हुए कि फ्लैंक मॉडल अभी भी सीएनएस मेटास्टेसिस का अध्ययन करने के लिए अच्छे प्रयोगात्मक मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं। दूसरा, इम्युनोकॉम्प्रोमाइज्ड जानवरों के उपयोग के परिणामस्वरूप ट्यूमर में प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ की कमी होती है और मेजबान द्वारा एक सामान्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया होती है, जिससे एक मौलिक तरीका सीमित हो जाता है जिसमें मेजबान कैंसरके विकास का मुकाबला करने का प्रयास करता है। जबकि मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ जुड़े मानवकृत चूहे ट्यूमर के साथ विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाओं की बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध हैं, फिर भीउन परिणामों के दृष्टिकोण, विधियों और व्याख्या के बारे में कई प्रश्न और विवाद हैं।
जबकि अधिकांश पीडीएक्स को आनुवंशिक रूप से स्थिर दिखाया गया है, हमने और अन्य लोगों ने दिखाया है कि दुर्लभ मामलों में, उपचार या अन्य बाहरी चयनात्मक दबावों की अनुपस्थिति में भी, ट्यूमर के क्लोन में परिवर्तन हो सकते हैं, जैसे कि मामूली क्लोन अधिग्रहण12,14,15। इसके परिणामस्वरूप आणविक प्रोफ़ाइल में नाटकीय परिवर्तन हो सकते हैं, जो अंततः ट्यूमर को रोगी ट्यूमर12 में प्रमुख क्लोन को प्रतिबिंबित नहीं करेगा। जबकि क्लोनल उत्तराधिकार प्रदर्शित करने वाले पीडीएक्स का उपयोग प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में किया जा सकता है, लक्ष्यीकरण के लिए अभिप्रेत कई जीन (जैसे, हर 2) क्लोनल उत्तराधिकार के साथ खो सकते हैं। इसलिए, यह निर्धारित करने के लिए पीडीएक्स मॉडल की लगातार स्क्रीनिंग को प्रोत्साहित किया जाता है कि क्या वे अभी भी वांछित क्लोन के आणविक प्रोफ़ाइल को बनाए रखते हैं।
सारांश में, पीडीएक्स मॉडल न केवल सीएनएस मेटास्टेसिस बल्कि अन्य ट्यूमर प्रकारों के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली का प्रतिनिधित्व करते हैं। इन मॉडलों को विकसित करने से पता चला है कि वे बड़े पैमाने पर मानव सीएनएस मेटास्टेसिस 8,9,10,12 के फेनोटाइपिक, आणविक प्रोफ़ाइल और विषमता को दर्शाते हैं। वे सीएनएस मेटास्टेसिस जीव विज्ञान दोनों का अध्ययन करने के लिए प्रभावी मॉडल के रूप में काम करते हैं और शारीरिक रूप से प्रासंगिक प्रीक्लिनिकल मॉडल के रूप में भी अच्छी तरह से काम करते हैं, जो ऐतिहासिक रूप से सीएनएस मेटास्टेसिस के विवो अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले अतिप्रयुक्त सेल लाइन मॉडल की जगह लेते हैं। निस्संदेह, पीडीएक्स और दाता रोगी ट्यूमर के बीच अंतर12,18 मौजूद है। यह जानना कि ये अंतर क्या हैं, प्रीक्लिनिकल अध्ययनों की उचित योजना और निष्पादन के लिए महत्वपूर्ण है। अंत में, कई टीकाकरण मार्गों के बीच चयन करके, पीडीएक्स मॉडल उनके उपयोग में बहुमुखी हैं जो रोग के कई पहलुओं के अध्ययन की अनुमति देते हैं। पीडीएक्स मॉडल निस्संदेह सीएनएस मेटास्टेसिस और उपन्यास चिकित्सा के विकास की हमारी समझ को आगे बढ़ाने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाएंगे।
The authors have nothing to disclose.
चित्रा 3 ए हमारे पिछले प्रकाशन12 से लिया गया था और मेयो क्लिनिक में डॉ जेन सरकारिया की प्रयोगशाला में उत्पन्न किया गया था।
25G needle | VWR | BD305122 | |
70 µm Cell strainer | VWR | 21008-952 | |
70% ethanol wipes | VWR | 470106-486 | |
Bone wax | MedVet | W31G-RL | |
CIEA NOG mouse | Taconic | NOG-F | |
DMEM | ThermoFisher | 11965092 | |
Ethiqa XR (buprenorphine SR) | MWI | 072117 | |
FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
gentleMACS C Tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi | 130-095-937 | |
Hamilton syringe | Sigma | 20919 | |
Matrigel growth factor reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
Ophthalmic ointment | MedVet | PH-PURALUBE-VET | |
PBS/DPBS | ThermoFisher | 14040133 | |
Povidone iodine swabs | VWR | 15648-906 | |
Stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
Surgical drill | Stoelting | 58610 | |
Surgical glue | MedVet | VG3 | |
Surgical sutures | MedVet | MMV-661-V | |
Syringe | VWR | 53548-001 | |
Tumor dissociation kit | Miltenyi | 130-095-929 |