중추신경계 전이 PDX 모델은 인간 전이의 표현형 및 분자적 특성을 나타내므로 전임상 연구를 위한 우수한 모델입니다. 여기에서는 PDX 모델을 설정하는 방법과 전임상 연구에 가장 적합한 접종 경로를 설명합니다.
중추신경계(CNS) 전이에 대한 새로운 치료법의 개발은 질병을 정확하게 나타내는 전임상 모델의 부족으로 인해 방해를 받았습니다. CNS 전이의 환자 유래 이종이식(PDX) 모델은 인간 질병의 표현형 및 분자 특성을 더 잘 나타낼 뿐만 아니라 역사적인 세포주 모델과 비교하여 인간 환자 종양의 이질성 및 클론 역학을 더 잘 반영하는 것으로 나타났습니다. 전임상 시험을 설정할 때 환자 유래 조직을 이식하는 데 사용할 수 있는 여러 부위가 있으며, 각각 고유한 장점과 단점이 있으며 각각 전이성 캐스케이드의 다양한 측면을 연구하는 데 적합합니다. 여기에서 프로토콜은 PDX 모델을 설정하는 방법을 설명하고 전임상 연구에서 CNS 전이 PDX 모델을 활용하기 위한 세 가지 다른 접근 방식을 제시하고 각 응용 프로그램과 한계에 대해 논의합니다. 여기에는 측면 이식, 뇌의 동소 주사 및 심장 내 주사가 포함됩니다. 피하 측면 이식은 모니터링하기 가장 쉽기 때문에 전임상 연구에 가장 편리합니다. 또한, 측면 이식으로 인한 뇌 및 기타 조직으로의 전이가 관찰되었으며, 이는 종양이 혈관내, 혈관외 유출 및 집락화를 포함한 여러 단계의 전이를 거쳤음을 나타냅니다. 뇌에 동소 주사는 뇌종양 미세 환경을 요약하는 가장 좋은 옵션이며 혈액-뇌 장벽(BBB)을 통과하지만 전이성 캐스케이드의 대부분의 단계를 우회하는 생물학적 제제의 효능을 결정하는 데 유용합니다. 심장 내 주사는 뇌로의 전이를 촉진하고 장기 향성 연구에도 유용합니다. 이 방법은 전이성 캐스케이드의 초기 단계를 생략하지만, 이러한 세포는 여전히 순환, 유출 및 식민지화에서 살아남아야 합니다. 따라서 PDX 모델의 유용성은 종양 접종 경로에 영향을 받으며 어떤 모델을 활용할지는 과학적 질문과 실험의 전반적인 목표에 따라 결정되어야 합니다.
중추 신경계 (CNS)로의 전이 발생률은 최근 몇 년 동안 증가했습니다 1,2,3. 종양 절제술, 전뇌 방사선 요법, 정위 방사선 수술과 같은 중추신경계 전이에 대한 전통적인 치료법은 대체로 완화적이고 완치가 거의 없으며 인지 기능 저하와 같은 쇠약해지는 부작용을 유발할 수 있다1. 최근, CNS 전이 치료를 위해 많은 새로운 표적 및 면역학적 치료법이 개발되고 있는데, 이는 부작용이 적으면서도 보다 효과적인 치료법이 될 가능성을 보여준다4.
전임상 결과를 의미 있는 임상 종점으로 변환하려면 종종 효과적이고 예측 가능한 모델링 전략이 필요합니다. 역사적으로 세포주 이종이식 모델은 CNS 전이 연구에서 전임상 연구의 표준이었습니다. 그러나, 이들 세포주 모델은 숙주 종양의 진정한 종양 거동을 반영하지 않거나, 질환의 조직학적 또는 분자적 이질성을 나타내지 않는다. 또한, 세포주 모델은 시험관내 성장 조건에 적응할 수 있으므로 숙주 종양의 원래 특성을 잃을 수 있습니다. 환자의 종양을 면역결핍 또는 인간화 마우스에 이식하는 환자 유래 이종이식(PDX)은 중개 암 연구에 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 연구자들은 PDX 모델이 일반적으로 종양 성장, 조직학적 특성을 충실하게 요약하고 종양 이질성, 전이 가능성 및 분자유전학적 특징을 유지할 수 있음을 보여주었습니다. 또한, PDX 모델은 PDX 종양 잠복기가 환자의 전체 생존율과 상관관계가 있는 예후이며, 환자 시험에서 치료 반응을 정확하게 예측하는 것으로 나타났다 5,6.
CNS 전이 PDX의 출현이 있었습니다. 대부분 비소세포폐암(NSCLC)7, 유방암8,9 및 흑색종 10,11과 같은 단일 기원에서 유래한 종양을 나타내는 것으로 개발되었습니다. 보다 최근에는, PDX 모델의 크고 다양한 컬렉션이 개발되고 특성화되었으며, 이는 8개의 상이한 조직학적 아형을 나타낸다 12. CNS 전이에 대한 PDX 모델은 조직학적으로나 분자적으로 원래 환자 종양과 매우 유사하며 조직학적 고유한 차이점과 유사성을 입증했습니다10,12. 또한, 대부분의 CNS 전이 PDX 모델은 인간 종양의 클론 이질성을 유지하지만, 일부는 클론 계승의 증거를 나타내어12 치료 후 클론 변화를 모니터링하여 치료에 대한 내성을 연구하는 데에도 이상적이다.
여기에 설명된 프로토콜은 PDX 확립 방법과 CNS 전이의 전임상 연구에 사용되는 다양한 접종 경로를 간략하게 설명합니다(그림 1). 이러한 이식 방법은 성장과 전이를 모방하는 능력이 다릅니다. 여기에서 프로토콜은 각 이식 경로에 대한 응용 프로그램을 강조하고 CNS 전이 연구에 사용할 수 있는 방법을 보여줍니다.
현재 원고에는 PDX 구축 및 전파 방법이 자세히 설명되어 있습니다. CNS 전이를 평가할 때 전임상 연구를 설정하는 데 사용할 수 있는 세 가지 다른 접종 방법도 입증되었습니다. 선택 방법은 실험의 목표에 따라 달라집니다. 어떤 경우에는 하나 이상의 접종 경로를 사용하는 것이 도움이 될 것입니다. 예를 들어, 피하 측면 이식은 종양 성장에 대한 약물의 효과를 연구하고 표적에서 약물을 평가하는 간단한 접근 방식을 제공하며 쉽게 모니터링하고 측정할 수 있는 종양 크기에 대한 시각 자료도 제공합니다. 그러나 일단 표적 타당성과 항종양 성장 특성이 확립되면 BBB를 교차하는 생물학적 제제의 효능을 평가하고 뇌종양 미세 환경 내에서 그 효과를 연구하기 위한 동종 연구를 설정할 수 있습니다. 또한 생존율은 동소 및 심장 내 주사 연구에서 더 잘 평가됩니다.
뇌 전이 PDX 모델의 두개내 주사는 종종 뇌 미세환경 및 BBB의 존재로 인해 선택되는 전임상 모델입니다. 그러나 연구에 따르면 뇌 전이는 종양에 대한 분자의 투과성에 영향을 미치는 BBB를 변형시키는 능력이 있습니다16. BBB의 이러한 변화는 두개내 이식된 종양에 의해 반영되지 않을 것이며, 이 때문에 전임상 약물 연구는 환자 종양의 반응을 완전히 반영하지 못할 수 있습니다. 이러한 경고에도 불구하고 두개내 주사는 전임상 모델에서 BBB를 통과하는 약물의 투과성과 효능을 테스트하는 가장 좋은 방법으로 남아 있습니다. 두개내 모델의 또 다른 과제는 종양 성장을 모니터링하기 어렵고 이미징 기술을 사용해야 한다는 것입니다. 형광 또는 생체발광 마커를 사용한 PDX의 바이러스 형질도입은 전통적으로 사용되어 왔지만 수행하기 어려울 수 있습니다. 그러나 마커의 도입이 필요하지 않은 마우스에서 사용하기 위해 여러 이미징 기술이 개발되고 있으며, 이는 전임상 연구를 위해 이러한 동소 뇌종양 모니터링의 용이성을 향상시킬 수 있습니다. 여기에는 자기 공명 영상(MRI) 및 양전자 방출 단층 촬영(PET) 영상 및 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(마이크로 CT)과 같은 영상 기술이 포함됩니다. 마지막으로, 두개내 주사는 연수막 전이와 같이 뇌 외부의 CNS 전이의 미세 환경을 정확하게 반영하지 못할 수 있습니다. 이 경우, 연수막 전이를 보다 정확하게 나타내기 위해 수조 마그나로의 주입을 시행할 수 있다17.
PDX 모델의 표현형 및 분자 특징의 특성화는 전임상 연구에 가장 적합한 모델을 선택하는 데 중요합니다. 종양 잠복기는 7-140일 범위일 수 있으며 복용률 또한 매우 가변적일 수 있다12. 이식할 최적의 동물 수와 치료 시작 시기는 각 PDX 모델의 특성을 기반으로 해야 하며 경험적으로 결정해야 합니다. 또한, PDX 종양의 분자 프로파일은 전임상 연구를 위한 가장 대표적인 PDX 모델의 선택에도 중요하다. 모델이 분자적으로 기증자 조직을 나타내는 것이 가까울수록 임상 반응을 더 잘 예측할 수 있습니다. 또한, 인간 데이터에서 선택된 표적이 연구를 위해 선택되는 PDX에 존재하고 클론 계승이 기존 우성 클론의 다른 게놈 프로파일과 관련이 있음을 보여주는 것처럼 몇 세대에 걸쳐 유지되도록 하는 것이 중요합니다. 이에 비추어 볼 때, 중추신경계 전이 PDX 종양의 표현형 및 분자 프로파일은 여러 세대에 걸쳐 광범위하게 특성화되었다12.
CNS 전이 PDX 모델을 사용하는 많은 장점에도 불구하고 사용과 관련된 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 대체 종양 미세 환경, 특히 면역 체계의 부족은 PDX 모델18의 잘 문서화된 한계입니다. 인간 종양을 마우스로 이종이식하는 것은 각각의 후속 계대마다 인간 간질을 생쥐 간질로 대체하는 결과를 가져오며, 인간 간질은 일반적으로 여러 계대 후에 완전히 대체된다19. 그러나, 종양 미세 환경의 차이는 원래 환자 종양과 비교하여 측면 이식 PDX종양의 분자 프로파일에 큰 차이를 초래하지 않으며, 이는 측면 모델이 여전히 CNS 전이를 연구하기에 좋은 실험 모델을 나타낸다는 것을 시사한다. 둘째, 면역저하 동물의 사용은 종양 내 면역 세포 침윤의 부족과 숙주에 의한 일반적인 면역 반응을 초래하여 숙주가 암 성장과 싸우려고 시도하는 근본적인 방법을 제한한다12. 인간 면역 세포가 이식된 인간화 마우스는 특정 면역 세포와 종양의 상호작용을 연구하는 데 사용할 수 있지만, 이러한 결과의 접근 방식, 방법 및 해석에 대해서는 여전히 많은 질문과 논란이 있다20.
대부분의 PDX가 유전적으로 안정한 것으로 나타났지만, 우리와 다른 사람들은 드물게 치료나 다른 외부 선택 압력이 없는 경우에도 마이너 클론 인수와 같은 종양 클론에 변화가 있을 수 있음을 보여주었습니다12,14,15. 이것은 분자 프로파일의 극적인 변화를 초래할 수 있으며, 이는 궁극적으로 종양이 환자 종양12에서 우성 클론을 반영하지 않게 만들 것이다. 클론 계승을 나타내는 PDX는 전임상 연구에서 사용할 수 있지만 표적화(예: Her2)를 위한 많은 유전자가 클론 계승으로 손실될 수 있습니다. 그러므로, PDX 모델들이 원하는 클론의 분자 프로파일을 여전히 유지하는지 여부를 결정하기 위해 PDX 모델을 자주 스크리닝하는 것이 권장된다.
요약하면, PDX 모델은 CNS 전이뿐만 아니라 다른 종양 유형의 연구를 위한 우수한 모델 시스템을 나타냅니다. 이러한 모델을 개발하면 인간 CNS 전이의 표현형, 분자 프로필 및 이질성을 크게 반영한다는 것이 밝혀졌습니다 8,9,10,12. 그들은 CNS 전이 생물학을 연구하기 위한 효과적인 모델 역할을 하고 또한 생리학적으로 관련된 전임상 모델로도 사용되어 역사적으로 CNS 전이의 생체 내 연구에 사용된 남용된 세포주 모델을 대체합니다. 의심할 여지 없이, PDX와 공여자 환자 종양 사이에는 차이가 존재한다12,18. 이러한 차이점이 무엇인지 아는 것은 전임상 연구의 적절한 계획과 실행에 중요합니다. 마지막으로, 여러 접종 경로 중에서 선택함으로써 PDX 모델은 질병의 여러 측면을 연구할 수 있는 다용도로 사용할 수 있습니다. PDX 모델은 의심할 여지 없이 CNS 전이에 대한 이해와 새로운 치료법 개발에 중요한 역할을 할 것입니다.
The authors have nothing to disclose.
그림 3A는 이전 간행물12 에서 발췌한 것으로 Mayo Clinic에 있는 Jann Sarkaria 박사의 연구실에서 생성되었습니다.
25G needle | VWR | BD305122 | |
70 µm Cell strainer | VWR | 21008-952 | |
70% ethanol wipes | VWR | 470106-486 | |
Bone wax | MedVet | W31G-RL | |
CIEA NOG mouse | Taconic | NOG-F | |
DMEM | ThermoFisher | 11965092 | |
Ethiqa XR (buprenorphine SR) | MWI | 072117 | |
FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
gentleMACS C Tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi | 130-095-937 | |
Hamilton syringe | Sigma | 20919 | |
Matrigel growth factor reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
Ophthalmic ointment | MedVet | PH-PURALUBE-VET | |
PBS/DPBS | ThermoFisher | 14040133 | |
Povidone iodine swabs | VWR | 15648-906 | |
Stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
Surgical drill | Stoelting | 58610 | |
Surgical glue | MedVet | VG3 | |
Surgical sutures | MedVet | MMV-661-V | |
Syringe | VWR | 53548-001 | |
Tumor dissociation kit | Miltenyi | 130-095-929 |