نقدم هنا بروتوكولا خطوة بخطوة لتوليد عضويات شبكية بشرية ناضجة واستخدامها في مقايسة سمية مستقبلات ضوئية لتحديد الأدوية المرشحة لمرض توسع الشعيرات البقعي المرتبط بالعمر من النوع 2 (MacTel).
توفر المواد العضوية منصة واعدة لدراسة آلية المرض والعلاجات ، مباشرة في سياق الأنسجة البشرية مع براعة وإنتاجية زراعة الخلايا. تستخدم عضويات الشبكية البشرية الناضجة لفحص العلاجات الصيدلانية المحتملة لمرض توسع الشعيرات البقعي المرتبط بالعمر من النوع 2 (MacTel).
لقد أظهرنا مؤخرا أن MacTel يمكن أن يكون ناتجا عن مستويات مرتفعة من أنواع الدهون غير النمطية ، deoxysphingolipids (deoxySLs). هذه الدهون سامة لشبكية العين وقد تؤدي إلى فقدان مستقبلات الضوء التي تحدث في مرضى MacTel. لفحص الأدوية لقدرتها على منع سمية مستقبلات الضوء deoxySL ، قمنا بتوليد عضويات شبكية بشرية من خط الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPSC) غير المستحث من MacTel ونضجها إلى عصر ما بعد الانقسام حيث يطورون جميع الخلايا المشتقة من السلالة العصبية في شبكية العين ، بما في ذلك المستقبلات الضوئية الناضجة وظيفيا. تمت معالجة عضويات الشبكية بمستقلب deoxySL وتم قياس موت الخلايا المبرمج داخل طبقة المستقبلات الضوئية باستخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية. باستخدام نموذج السمية هذا ، تم فحص المركبات الدوائية التي تمنع موت المستقبلات الضوئية الناجم عن deoxySL. باستخدام نهج مرشح مستهدف ، قررنا أن فينوفايبرات ، وهو دواء يوصف عادة لعلاج ارتفاع الكوليسترول والدهون الثلاثية ، يمكن أن يمنع أيضا سمية deoxySL في خلايا شبكية العين.
نجح فحص السمية في تحديد دواء معتمد من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية يمكنه منع موت المستقبلات الضوئية. هذه نتيجة قابلة للتنفيذ بشكل مباشر بسبب النموذج ذي الصلة بالمرض الذي تم اختباره. يمكن تعديل هذه المنصة بسهولة لاختبار أي عدد من الضغوطات الأيضية والتدخلات الدوائية المحتملة لاكتشاف العلاج في المستقبل في أمراض الشبكية.
قدمت نمذجة الأمراض البشرية في زراعة الخلايا والنماذج الحيوانية أدوات لا تقدر بثمن لاكتشاف وتعديل والتحقق من صحة العلاجات الدوائية ، مما يسمح لها بالتقدم من دواء مرشح إلى علاج معتمد. على الرغم من أن الجمع بين النماذج في المختبر وغير البشرية في الجسم الحي كان منذ فترة طويلة مكونا حاسما في خط أنابيب تطوير الأدوية ، إلا أنها تفشل في كثير من الأحيان في التنبؤ بالأداء السريري للأدوية المرشحة الجديدة1. هناك حاجة واضحة لتطوير التقنيات التي تسد الفجوة بين الزراعات الأحادية الخلوية البشرية المبسطة والتجارب السريرية. أدت التطورات التكنولوجية الحديثة في مزارع الأنسجة ثلاثية الأبعاد ذاتية التنظيم ، العضوية ، إلى تحسين دقتها للأنسجة التي تضعها في نمذجتها مما يجعلها أدوات واعدة في خط أنابيب تطوير الأدوية قبل السريرية2.
الميزة الرئيسية لزراعة الخلايا البشرية على النماذج غير البشرية في الجسم الحي هي القدرة على تكرار التعقيدات المحددة لعملية التمثيل الغذائي البشري والتي يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا حتى بين الفقاريات ذات الترتيب الأعلى مثل البشر والفئران3. ومع ذلك ، يمكن أن تطغى على هذه الخصوصية فقدان في تعقيد الأنسجة. هذا هو الحال بالنسبة لأنسجة الشبكية حيث تتشابك أنواع متعددة من الخلايا بشكل معقد ولها تفاعل استقلابي تكافلي فريد بين الأنواع الفرعية الخلوية التي لا يمكن تكرارها في الزراعة الأحادية4. الكائنات العضوية البشرية ، التي توفر نسخة طبق الأصل من الأنسجة البشرية المعقدة مع إمكانية الوصول إلى زراعة الخلايا وقابليتها للتوسع ، لديها القدرة على التغلب على أوجه القصور في منصات نمذجة الأمراض هذه.
أثبتت عضويات الشبكية المشتقة من الخلايا الجذعية أنها مخلصة بشكل خاص في نمذجة الأنسجة المعقدة للشبكية العصبية البشرية5. وقد جعل هذا النموذج العضوي للشبكية تقنية واعدة لدراسة وعلاج أمراض الشبكية 6,7. حتى الآن ، ركزت الكثير من نمذجة المرض في عضويات الشبكية على أمراض الشبكية أحادية المنشأ حيث يتم اشتقاق عضويات الشبكية من خطوط iPSC مع المتغيرات الجينية المسببة للأمراض7. هذه بشكل عام طفرات عالية الاختراق تظهر كأنماط ظاهرية تنموية. تم القيام بعمل أقل بشكل فعال على أمراض الشيخوخة حيث تؤثر الطفرات الجينية والضغوطات البيئية على الأنسجة التي تطورت بشكل طبيعي. يمكن أن يكون للأمراض التنكسية العصبية للشيخوخة وراثة جينية معقدة ومساهمات من الضغوطات البيئية التي يصعب بنمذجتها بطبيعتها باستخدام مزارع الخلايا قصيرة الأجل. ومع ذلك ، في كثير من الحالات ، يمكن أن تتجمع هذه الأمراض المعقدة على الضغوطات الخلوية أو الأيضية الشائعة التي ، عند اختبارها على أنسجة بشرية متطورة بالكامل ، يمكن أن توفر رؤى قوية للأمراض التنكسية العصبية للشيخوخة8.
يعد المرض التنكسي البقعي المتأخر ، توسع الشعيرات البقعي من النوع الثاني (MacTel) ، مثالا رائعا على مرض تنكسي عصبي معقد وراثيا يتجمع على عيب استقلابي شائع. MacTel هو مرض تنكسي غير شائع في شبكية العين يؤدي إلى فقدان مستقبلات الضوء ومولر الدبقية في البقعة ، مما يؤدي إلى فقدان تدريجي في الرؤية المركزية9،10،11،12،13. في MacTel ، يؤدي الوراثة الجينية غير المحددة ، وربما متعددة العوامل ، إلى انخفاض شائع في سيرين الدورة الدموية في المرضى ، مما يؤدي إلى زيادة في أنواع الدهون السمية العصبية تسمى deoxysphingolipids (deoxySL) 14,15. لإثبات أن تراكم deoxySL سام لشبكية العين وللتحقق من صحة العلاجات الصيدلانية المحتملة ، قمنا بتطوير هذا البروتوكول لفحص سمية المستقبلات الضوئية في عضويات شبكية العين البشرية14.
نحدد هنا بروتوكولا محددا للتمييز بين عضويات الشبكية البشرية ، وإنشاء مقايسة السمية والإنقاذ باستخدام المواد العضوية ، وتحديد النتائج. نحن نقدم مثالا ناجحا حيث نحدد السمية الخاصة بالأنسجة لعامل مسبب للمرض المشتبه به ، deoxySL ، ونتحقق من صحة استخدام دواء عام آمن ، fenofibrate ، للعلاج المحتمل لسمية الشبكية التي يسببها deoxySL. أظهرت الأعمال السابقة أن فينوفايبرات يمكن أن يزيد من تدهور deoxySL وانخفاض deoxySL المنتشر في المرضى ، ومع ذلك ، لم يتم اختبار فعاليته في الحد من سمية الشبكية التي يسببها deoxySL16,17. على الرغم من أننا نقدم مثالا محددا ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقييم تأثير أي عدد من الضغوطات الأيضية / البيئية والأدوية العلاجية المحتملة على أنسجة الشبكية.
اختلافات بروتوكول التمايز
منذ اختراع الأكواب البصرية ذاتية التكوين من قبل مجموعة YoshikiSasai 20 ، طورت العديد من المختبرات بروتوكولات لتوليد عضويات شبكية يمكن أن تختلف في كل خطوة تقريبا5،18،19،21. يمكن …
The authors have nothing to disclose.
بدعم من معهد لوي للبحوث الطبية. نود أن نشكر عائلة لوي على دعمهم لمشروع MacTel. نود أن نشكر ماري جانتنر ومايك دوريل وليا شيبك على مساهمتهم الفكرية ومساعدتهم في إعداد المخطوطة.
0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
125mL Erlenmeyer Flasks | VWR | 89095-258 | |
1-deoxysphinganine | Avanti | 860493 | |
B27 Supplement, minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
Beaver 6900 Mini-Blade | Beaver-Visitec | BEAVER6900 | |
D-(+)-Sucrose | VWR | 97061-432 | |
DAPI | Thermo-fisher | D1306 | |
Dispase II, powder | Gibco | 17105041 | |
DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 11995073 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11330 | |
Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555 | Thermo-fisher | A32794 | |
donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
FBS, Heat Inactivated | Corning | 45001-108 | |
Fenofibrate | Sigma | F6020 | |
Glutamax | Gibco | 35050061 | |
Heparin | Stemcell Technologies | 7980 | |
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin | Sigma | 11684795910 | |
Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356230 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
mTeSR 1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
N2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Pierce 16% Formaldehyde | Thermo-fisher | 28906 | |
Rabbit anti-Recoverin antibody | Millipore | AB5585 | |
Sodium Citrate | Sigma | W302600 | |
Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units | MilliporeSigma | SE1M179M6 | |
Taurine | Sigma | T0625 | |
Tissue Plus- O.C.T. compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
Tissue-Tek Cryomold | EMS | 62534-10 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | |
Tween-20 | Sigma | P1379 | |
Ultra-Low Attachment 6 well Plates | Corning | 29443-030 | |
Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask | Corning | 3814 | |
Vacuum Filtration System | VWR | 10040-436 | |
Vectashield-mounting medium | vector Labs | H-1000 | |
wax pen-ImmEdge | vector Labs | H-4000 | |
Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor) | Sigma | Y0503 |