Toksicitetsskærme i humane retinale organoider til farmaceutisk opdagelse
Summary
Her præsenterer vi en trinvis protokol til generering af modne humane retinale organoider og udnytter dem i et fotoreceptortoksicitetsassay for at identificere farmaceutiske kandidater til den aldersrelaterede retinale degenerative sygdom makulær telangiectasia type 2 (MacTel).
Abstract
Organoider giver en lovende platform til at studere sygdomsmekanismer og behandlinger direkte i forbindelse med humant væv med alsidighed og gennemstrømning af cellekultur. Modne humane retinale organoider bruges til at screene potentielle farmaceutiske behandlinger for den aldersrelaterede retinale degenerative sygdom makulær telangiectasia type 2 (MacTel).
Vi har for nylig vist, at MacTel kan være forårsaget af forhøjede niveauer af en atypisk lipidart, deoxysphingolipider (deoxySL’er). Disse lipider er giftige for nethinden og kan drive fotoreceptortabet, der opstår hos MacTel-patienter. For at screene lægemidler for deres evne til at forhindre deoxySL-fotoreceptortoksicitet genererede vi humane retinale organoider fra en ikke-MacTel-induceret pluripotent stamcellelinje (iPSC) og modnede dem til en postmitotisk alder, hvor de udvikler alle de neuronale afstamningsafledte celler i nethinden, herunder funktionelt modne fotoreceptorer. De retinale organoider blev behandlet med en deoxySL-metabolit, og apoptose blev målt inden for fotoreceptorlaget ved hjælp af immunhistokemi. Ved hjælp af denne toksicitetsmodel blev farmakologiske forbindelser, der forhindrer deoxySL-induceret fotoreceptordød, screenet. Ved hjælp af en målrettet kandidattilgang fastslog vi, at fenofibrat, et lægemiddel, der almindeligvis ordineres til behandling af højt kolesteroltal og triglycerider, også kan forhindre deoxySL-toksicitet i cellerne i nethinden.
Toksicitetsskærmen identificerede med succes et FDA-godkendt lægemiddel, der kan forhindre fotoreceptordød. Dette er et direkte handlingsmæssigt fund på grund af den meget sygdomsrelevante model, der testes. Denne platform kan let ændres til at teste et vilkårligt antal metaboliske stressorer og potentielle farmakologiske indgreb til fremtidig behandlingsopdagelse i nethindesygdomme.
Introduction
Modellering af menneskelig sygdom i cellekultur og dyremodeller har givet uvurderlige værktøjer til opdagelse, modifikation og validering af farmakologisk terapi, så de kan gå videre fra kandidatlægemiddel til godkendt behandling. Selv om en kombination af in vitro- og ikke-humane in vivo-modeller længe har været en kritisk komponent i lægemiddeludviklingspipelinen, undlader de ofte at forudsige den kliniske ydeevne af nye lægemiddelkandidater1. Der er et klart behov for udvikling af teknologier, der bygger bro mellem forenklede humane cellulære monokulturer og kliniske forsøg. Nylige teknologiske fremskridt inden for selvorganiserede tredimensionelle vævskulturer, organoider, har forbedret deres troskab til de væv, de modellerer, hvilket gør dem lovende værktøjer i den prækliniske lægemiddeludviklingspipeline2.
En stor fordel ved human cellekultur i forhold til ikke-menneskelige in vivo-modeller er evnen til at replikere de specifikke forviklinger i menneskelig metabolisme, som kan variere betydeligt selv mellem hvirveldyr af højere orden som mennesker og mus3. Denne specificitet kan imidlertid overskygges af et tab i vævskompleksitet; Dette er tilfældet for nethindevæv, hvor flere celletyper er indviklet sammenvævet og har et unikt symbiotisk metabolisk samspil mellem cellulære undertyper, der ikke kan replikeres i en monokultur4. Humane organoider, som giver en faksimile af komplekse humane væv med tilgængelighed og skalerbarhed af cellekultur, har potentialet til at overvinde manglerne ved disse sygdomsmodelleringsplatforme.
Retinale organoider afledt af stamceller har vist sig at være særligt trofaste i modellering af det komplekse væv i den menneskelige neurale nethinden5. Dette har gjort retinal organoidmodellen til en lovende teknologi til undersøgelse og behandling af retinal sygdom 6,7. Hidtil har meget af sygdomsmodelleringen i retinale organoider fokuseret på monogene nethindesygdomme, hvor retinale organoider stammer fra iPSC-linjer med sygdomsfremkaldende genetiske varianter7. Disse er generelt meget penetrerende mutationer, der manifesterer sig som udviklingsfænotyper. Mindre arbejde er blevet effektivt gjort på aldrende sygdomme, hvor genetiske mutationer og miljømæssige stressfaktorer påvirker væv, der har udviklet sig normalt. Neurodegenerative aldringssygdomme kan have kompleks genetisk arv og bidrag fra miljømæssige stressfaktorer, der i sagens natur er vanskelige at modellere ved hjælp af kortvarige cellekulturer. Imidlertid kan disse komplekse sygdomme i mange tilfælde samles på almindelige cellulære eller metaboliske stressfaktorer, der, når de testes på et fuldt udviklet humant væv, kan give kraftig indsigt i neurodegenerative aldringssygdomme8.
Den sent indsættende makuladegenerative sygdom, makula telangiectasia type II (MacTel), er et godt eksempel på en genetisk kompleks neurodegenerativ sygdom, der samler sig på en fælles metabolisk defekt. MacTel er en usædvanlig retinal degenerativ aldringssygdom, der resulterer i fotoreceptor og Müller glia tab i makulaen, hvilket fører til et progressivt tab i centralt syn 9,10,11,12,13. I MacTel driver en ubestemt, muligvis multifaktoriel, genetisk arv en almindelig reduktion i cirkulerende serin hos patienter, hvilket resulterer i en stigning i en neurotoksisk lipidart kaldet deoxysphingolipider (deoxySL)14,15. For at bevise, at akkumulering af deoxySL er giftigt for nethinden og for at validere potentielle farmaceutiske behandlinger, udviklede vi denne protokol til at analysere fotoreceptortoksicitet i humane retinale organoider14.
Her skitserer vi en specifik protokol til differentiering af humane retinale organoider, etablering af et toksicitets- og redningsassay ved hjælp af organoider og kvantificering af resultater. Vi giver et vellykket eksempel, hvor vi bestemmer den vævsspecifikke toksicitet af et mistænkt sygdomsfremkaldende middel, deoxySL, og validerer brugen af et sikkert generisk lægemiddel, fenofibrat, til potentiel behandling af deoxySL-induceret retinal toksicitet. Tidligere arbejde har vist, at fenofibrat kan øge nedbrydningen af deoxySL og lavere cirkulerende deoxySL hos patienter, men dets effektivitet til reduktion af deoxySL-induceret retinal toksicitet er ikke blevet testet16,17. Selvom vi præsenterer et specifikt eksempel, kan denne protokol bruges til at evaluere effekten af et vilkårligt antal metaboliske / miljømæssige stressorer og potentielle terapeutiske lægemidler på nethindevæv.
Protocol
Representative Results
Discussion
Variationer i differentieringsprotokol
Siden opfindelsen af selvdannende optiske kopper af Yoshiki Sasais gruppe20 har mange laboratorier udviklet protokoller til generering af retinale organoider, der kan variere ved næsten hvert trin 5,18,19,21. En udtømmende liste over protokoller findes i Capowski et al.22. Den differenti…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Støttet af Lowy Medical Research Institute. Vi vil gerne takke Lowy-familien for deres støtte til MacTel-projektet. Vi vil gerne takke Mari Gantner, Mike Dorrell og Lea Scheppke for deres intellektuelle input og hjælp til at udarbejde manuskriptet.
Materials
| 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| 125mL Erlenmeyer Flasks | VWR | 89095-258 | |
| 1-deoxysphinganine | Avanti | 860493 | |
| B27 Supplement, minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Beaver 6900 Mini-Blade | Beaver-Visitec | BEAVER6900 | |
| D-(+)-Sucrose | VWR | 97061-432 | |
| DAPI | Thermo-fisher | D1306 | |
| Dispase II, powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 11995073 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330 | |
| Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555 | Thermo-fisher | A32794 | |
| donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| FBS, Heat Inactivated | Corning | 45001-108 | |
| Fenofibrate | Sigma | F6020 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| Heparin | Stemcell Technologies | 7980 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin | Sigma | 11684795910 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356230 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| mTeSR 1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo-fisher | 28906 | |
| Rabbit anti-Recoverin antibody | Millipore | AB5585 | |
| Sodium Citrate | Sigma | W302600 | |
| Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units | MilliporeSigma | SE1M179M6 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| Tissue Plus- O.C.T. compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Tissue-Tek Cryomold | EMS | 62534-10 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Ultra-Low Attachment 6 well Plates | Corning | 29443-030 | |
| Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask | Corning | 3814 | |
| Vacuum Filtration System | VWR | 10040-436 | |
| Vectashield-mounting medium | vector Labs | H-1000 | |
| wax pen-ImmEdge | vector Labs | H-4000 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor) | Sigma | Y0503 |
Referências
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J. Engineered tissues and strategies to overcome challenges in drug development. Advances in Drug Delivery Reviews. 158, 116-139 (2020).
- Demetrius, L. Of mice and men. When it comes to studying ageing and the means to slow it down, mice are not just small humans. EMBO Reports. , 39-44 (2005).
- Lindsay, K. J., et al. Pyruvate kinase and aspartate-glutamate carrier distributions reveal key metabolic links between neurons and glia in retina. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111 (43), 15579-15584 (2014).
- Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
- Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
- Sinha, D., Phillips, J., Phillips, M. J., Gamm, D. M. Mimicking retinal development and disease with human pluripotent stem cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (5), 1-9 (2016).
- Gan, L., Cookson, M. R., Petrucelli, L., La Spada, A. R. Converging pathways in neurodegeneration, from genetics to mechanisms. Nature Neuroscience. 21 (10), 1300-1309 (2018).
- Aung, K. Z., Wickremasinghe, S. S., Makeyeva, G., Robman, L., Guymer, R. H. The prevalence estimates of macular telangiectasia type 2: the Melbourne collaborative cohort study. Retina. 30 (3), 473-478 (2010).
- Chew, E. Y., et al. Effect of ciliary neurotrophic factor on retinal neurodegeneration in patients with macular telangiectasia type 2: A randomized clinical trial. Ophthalmology. 126 (4), 540-549 (2019).
- Gass, J. D., Blodi, B. A. Idiopathic juxtafoveolar retinal telangiectasis. Update of classification and follow-up study. Ophthalmology. 100 (10), 1536-1546 (1993).
- Klein, R., et al. The prevalence of macular telangiectasia type 2 in the Beaver Dam eye study. American Journal of Ophthalmology. 150 (1), 55-62 (2010).
- Powner, M. B., et al. Loss of Muller’s cells and photoreceptors in macular telangiectasia type 2. Ophthalmology. 120 (11), 2344-2352 (2013).
- Gantner, M. L., et al. Serine and lipid metabolism in macular disease and peripheral neuropathy. New England Journal of Medicine. 381 (15), 1422-1433 (2019).
- Scerri, T. S., et al. Genome-wide analyses identify common variants associated with macular telangiectasia type 2. Nature Genetics. 49 (4), 559-567 (2017).
- Alecu, I., et al. Cytotoxic 1-deoxysphingolipids are metabolized by a cytochrome P450-dependent pathway. Journal of Lipid Research. 58 (1), 60-71 (2017).
- Othman, A., et al. Fenofibrate lowers atypical sphingolipids in plasma of dyslipidemic patients: A novel approach for treating diabetic neuropathy. Journal of Clinical Lipidology. 9 (4), 568-575 (2015).
- Ohlemacher, S. K., Iglesias, C. L., Sridhar, A., Gamm, D. M., Meyer, J. S. Generation of highly enriched populations of optic vesicle-like retinal cells from human pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 32, 1-20 (2015).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communication. 5, 4047 (2014).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Science Reports. 7 (1), 766 (2017).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
- Luo, Z., et al. An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation. Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).
- Ovando-Roche, P., et al. Use of bioreactors for culturing human retinal organoids improves photoreceptor yields. Stem Cell Research Therapy. 9 (1), 156 (2018).
