Criblages de toxicité dans les organoïdes rétiniens humains pour la découverte pharmaceutique
Summary
Nous présentons ici un protocole étape par étape pour générer des organoïdes rétiniens humains matures et les utiliser dans un test de toxicité des photorécepteurs afin d’identifier des candidats pharmaceutiques pour la maladie dégénérative rétinienne liée à l’âge, la télangiectasie maculaire de type 2 (MacTel).
Abstract
Les organoïdes fournissent une plate-forme prometteuse pour étudier le mécanisme et les traitements de la maladie, directement dans le contexte des tissus humains avec la polyvalence et le débit de la culture cellulaire. Les organoïdes rétiniens humains matures sont utilisés pour dépister les traitements pharmaceutiques potentiels pour la maladie dégénérative rétinienne liée à l’âge télangiectasie maculaire de type 2 (MacTel).
Nous avons récemment montré que MacTel peut être causé par des niveaux élevés d’une espèce lipidique atypique, les désoxysphingolipides (deoxySLs). Ces lipides sont toxiques pour la rétine et peuvent entraîner la perte de photorécepteurs qui se produit chez les patients MacTel. Pour dépister la capacité des médicaments à prévenir la toxicité des photorécepteurs du désoxySL, nous avons généré des organoïdes rétiniens humains à partir d’une lignée de cellules souches pluripotentes non induites par MacTel (CSPi) et les avons mûris jusqu’à un âge post-mitotique où ils développent toutes les cellules dérivées de la lignée neuronale de la rétine, y compris les photorécepteurs fonctionnellement matures. Les organoïdes rétiniens ont été traités avec un métabolite deoxySL et l’apoptose a été mesurée dans la couche photoréceptrice par immunohistochimie. À l’aide de ce modèle de toxicité, des composés pharmacologiques qui empêchent la mort des photorécepteurs induite par le désoxySL ont été examinés. À l’aide d’une approche candidate ciblée, nous avons déterminé que le fénofibrate, un médicament couramment prescrit pour le traitement de l’hypercholestérolémie et des triglycérides, peut également prévenir la toxicité du désoxySL dans les cellules de la rétine.
L’écran de toxicité a permis d’identifier avec succès un médicament approuvé par la FDA qui peut prévenir la mort des photorécepteurs. Il s’agit d’une découverte directement exploitable en raison du modèle hautement pertinent pour la maladie testé. Cette plateforme peut être facilement modifiée pour tester un certain nombre de facteurs de stress métaboliques et d’interventions pharmacologiques potentielles pour la découverte de futurs traitements dans les maladies de la rétine.
Introduction
La modélisation des maladies humaines dans des cultures cellulaires et des modèles animaux a fourni des outils inestimables pour la découverte, la modification et la validation de thérapies pharmacologiques, leur permettant de passer d’un médicament candidat à un traitement approuvé. Bien qu’une combinaison de modèles in vitro et non humains in vivo soit depuis longtemps un élément essentiel du pipeline de développement de médicaments, ils échouent souvent à prédire les performances cliniques des nouveaux candidatsmédicaments 1. Il existe un besoin évident de développer des technologies qui comblent le fossé entre les monocultures cellulaires humaines simplistes et les essais cliniques. Les progrès technologiques récents dans les cultures tissulaires tridimensionnelles auto-organisées, les organoïdes, ont amélioré leur fidélité aux tissus qu’ils modélisent, ce qui en fait des outils prometteurs dans le pipeline de développement de médicaments précliniques2.
Un avantage majeur de la culture cellulaire humaine par rapport aux modèles in vivo non humains est la capacité de reproduire les subtilités spécifiques du métabolisme humain qui peuvent varier considérablement même entre des vertébrés d’ordre supérieur tels que les humains et les souris3. Cependant, cette spécificité peut être éclipsée par une perte de complexité tissulaire; C’est le cas du tissu rétinien où plusieurs types de cellules sont étroitement entrelacés et ont une interaction métabolique symbiotique unique entre les sous-types cellulaires qui ne peuvent pas être reproduits dans une monoculture4. Les organoïdes humains, qui fournissent un fac-similé de tissus humains complexes avec l’accessibilité et l’évolutivité de la culture cellulaire, ont le potentiel de surmonter les lacunes de ces plateformes de modélisation des maladies.
Les organoïdes rétiniens dérivés de cellules souches se sont révélés particulièrement fidèles dans la modélisation du tissu complexe de la rétine neurale humaine5. Cela a fait du modèle organoïde rétinien une technologie prometteuse pour l’étude et le traitement des maladies rétiniennes 6,7. À ce jour, une grande partie de la modélisation de la maladie dans les organoïdes rétiniens s’est concentrée sur les maladies rétiniennes monogéniques où les organoïdes rétiniens sont dérivés de lignées iPSC avec des variantes génétiques causant la maladie7. Ce sont généralement des mutations très pénétrantes qui se manifestent par des phénotypes développementaux. Moins de travail a été fait efficacement sur les maladies du vieillissement où les mutations génétiques et les facteurs de stress environnementaux ont un impact sur les tissus qui se sont développés normalement. Les maladies neurodégénératives du vieillissement peuvent avoir un héritage génétique complexe et des contributions de facteurs de stress environnementaux qui sont intrinsèquement difficiles à modéliser à l’aide de cultures cellulaires à court terme. Cependant, dans de nombreux cas, ces maladies complexes peuvent fusionner sur des facteurs de stress cellulaires ou métaboliques communs qui, lorsqu’ils sont testés sur un tissu humain pleinement développé, peuvent fournir des informations puissantes sur les maladies neurodégénératives du vieillissement8.
La maladie dégénérative maculaire tardive, la télangiectasie maculaire de type II (MacTel), est un excellent exemple d’une maladie neurodégénérative génétiquement complexe qui fusionne sur un défaut métabolique commun. MacTel est une maladie dégénérative rétinienne rare du vieillissement qui entraîne une perte de photorécepteur et de glie de Müller dans la macula, entraînant une perte progressive de la vision centrale 9,10,11,12,13. Chez MacTel, un héritage génétique indéterminé, peut-être multifactoriel, entraîne une réduction commune de la sérine circulante chez les patients, ce qui entraîne une augmentation d’une espèce lipidique neurotoxique appelée désoxysphingolipides (deoxySL)14,15. Pour prouver que l’accumulation de deoxySL est toxique pour la rétine et pour valider les thérapies pharmaceutiques potentielles, nous avons développé ce protocole pour tester la toxicité des photorécepteurs dans les organoïdes rétiniens humains14.
Nous décrivons ici un protocole spécifique pour différencier les organoïdes rétiniens humains, établir un test de toxicité et de sauvetage à l’aide d’organoïdes et quantifier les résultats. Nous fournissons un exemple réussi où nous déterminons la toxicité spécifique aux tissus d’un agent pathogène soupçonné, le désoxySL, et validons l’utilisation d’un médicament générique sûr, le fénofibrate, pour le traitement potentiel de la toxicité rétinienne induite par le désoxySL. Des travaux antérieurs ont montré que le fénofibrate peut augmenter la dégradation du désoxySL et réduire le désoxySL circulant chez les patients, cependant, son efficacité dans la réduction de la toxicité rétinienne induite par le désoxySL n’a pas été testée16,17. Bien que nous présentions un exemple spécifique, ce protocole peut être utilisé pour évaluer l’effet d’un certain nombre de facteurs de stress métaboliques / environnementaux et de médicaments thérapeutiques potentiels sur le tissu rétinien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Variations du protocole de différenciation
Depuis l’invention des cupules optiques autoformées par le groupe20 de Yoshiki Sasai, de nombreux laboratoires ont développé des protocoles pour générer des organoïdes rétiniens qui peuvent varier à presque chaque étape 5,18,19,21. Une liste exhaustive des protocoles peut être trouvée dans Capow…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Soutenu par le Lowy Medical Research Institute. Nous tenons à remercier la famille Lowy pour son soutien au projet MacTel. Nous tenons à remercier Mari Gantner, Mike Dorrell et Lea Scheppke pour leur contribution intellectuelle et leur aide à la préparation du manuscrit.
Materials
| 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| 125mL Erlenmeyer Flasks | VWR | 89095-258 | |
| 1-deoxysphinganine | Avanti | 860493 | |
| B27 Supplement, minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Beaver 6900 Mini-Blade | Beaver-Visitec | BEAVER6900 | |
| D-(+)-Sucrose | VWR | 97061-432 | |
| DAPI | Thermo-fisher | D1306 | |
| Dispase II, powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 11995073 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330 | |
| Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555 | Thermo-fisher | A32794 | |
| donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| FBS, Heat Inactivated | Corning | 45001-108 | |
| Fenofibrate | Sigma | F6020 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| Heparin | Stemcell Technologies | 7980 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin | Sigma | 11684795910 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356230 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| mTeSR 1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo-fisher | 28906 | |
| Rabbit anti-Recoverin antibody | Millipore | AB5585 | |
| Sodium Citrate | Sigma | W302600 | |
| Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units | MilliporeSigma | SE1M179M6 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| Tissue Plus- O.C.T. compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Tissue-Tek Cryomold | EMS | 62534-10 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Ultra-Low Attachment 6 well Plates | Corning | 29443-030 | |
| Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask | Corning | 3814 | |
| Vacuum Filtration System | VWR | 10040-436 | |
| Vectashield-mounting medium | vector Labs | H-1000 | |
| wax pen-ImmEdge | vector Labs | H-4000 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor) | Sigma | Y0503 |
Referências
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