Rastreios de toxicidade em organoides da retina humana para descoberta farmacêutica
Summary
Aqui apresentamos um protocolo passo-a-passo para gerar organoides humanos maduros da retina e utilizá-los em um ensaio de toxicidade de fotorreceptores para identificar candidatos farmacêuticos para a doença degenerativa retiniana relacionada à idade telangiectasia macular tipo 2 (MacTel).
Abstract
Os organoides fornecem uma plataforma promissora para estudar o mecanismo e os tratamentos de doenças, diretamente no contexto do tecido humano com a versatilidade e rendimento da cultura celular. Organoides da retina humana madura são utilizados para rastrear potenciais tratamentos farmacêuticos para a doença degenerativa retiniana relacionada à idade telangiectasia macular tipo 2 (MacTel).
Recentemente, demonstramos que MacTel pode ser causado por níveis elevados de uma espécie lipídica atípica, os desoxiesfingolipídios (deoxySLs). Esses lipídios são tóxicos para a retina e podem conduzir a perda de fotorreceptores que ocorre em pacientes com MacTel. Para rastrear drogas quanto à sua capacidade de prevenir a toxicidade dos fotorreceptores desoxiSL, geramos organoides da retina humana a partir de uma linhagem de células-tronco pluripotentes (iPSC) não induzida por MacTel e os amadurecemos até uma idade pós-mitótica, onde eles desenvolvem todas as células derivadas da linhagem neuronal da retina, incluindo fotorreceptores funcionalmente maduros. Os organoides da retina foram tratados com um metabólito deoxySL e a apoptose foi medida dentro da camada fotorreceptora usando imunohistoquímica. Usando este modelo de toxicidade, compostos farmacológicos que previnem a morte dos fotorreceptores induzidos por desoxiSL foram triados. Usando uma abordagem candidata direcionada, determinamos que o fenofibrato, um medicamento comumente prescrito para o tratamento de colesterol e triglicérides elevados, também pode prevenir a toxicidade do desoxiSL nas células da retina.
A triagem de toxicidade identificou com sucesso uma droga aprovada pela FDA que pode prevenir a morte de fotorreceptores. Este é um achado diretamente acionável devido ao modelo altamente relevante para a doença testado. Esta plataforma pode ser facilmente modificada para testar qualquer número de estressores metabólicos e potenciais intervenções farmacológicas para futuras descobertas de tratamento em doenças da retina.
Introduction
A modelagem de doenças humanas em cultura de células e modelos animais tem fornecido ferramentas inestimáveis para a descoberta, modificação e validação de terapêuticas farmacológicas, permitindo que elas avancem de uma droga candidata para uma terapia aprovada. Embora uma combinação de modelos in vitro e in vivo não humanos tenha sido um componente crítico do pipeline de desenvolvimento de fármacos, eles frequentemente falham em prever o desempenho clínico de novos candidatos a fármacos1. Há uma clara necessidade de desenvolvimento de tecnologias que preencham a lacuna entre monoculturas celulares humanas simplistas e ensaios clínicos. Avanços tecnológicos recentes em culturas tridimensionais auto-organizadas de tecidos, organoides, têm melhorado sua fidelidade aos tecidos por eles modelados, tornando-os ferramentas promissoras no pipeline de desenvolvimento pré-clínico de fármacos2.
Uma grande vantagem da cultura de células humanas sobre modelos in vivo não humanos é a capacidade de replicar os meandros específicos do metabolismo humano, que podem variar consideravelmente mesmo entre vertebrados de ordem superior, como humanos e camundongos3. No entanto, essa especificidade pode ser ofuscada pela perda de complexidade tecidual; É o caso do tecido da retina, onde vários tipos celulares estão intrinsecamente entrelaçados e têm uma interação metabólica simbiótica única entre subtipos celulares que não podem ser replicados em monocultura4. Os organoides humanos, que fornecem um fac-símile de tecidos humanos complexos com a acessibilidade e escalabilidade da cultura celular, têm o potencial de superar as deficiências dessas plataformas de modelagem de doenças.
Organoides da retina derivados de células-tronco têm se mostrado particularmente fiéis na modelagem do complexo tecido da retina neural humana5. Isso tornou o modelo organoide da retina uma tecnologia promissora para o estudo e tratamento das doençasretinianas6,7. Até o momento, grande parte da modelagem da doença em organoides da retina tem se concentrado em doenças retinianas monogênicas, onde organoides da retina são derivados de linhagens iPSC com variantes genéticas causadoras de doenças7. Estas são geralmente mutações altamente penetrantes que se manifestam como fenótipos de desenvolvimento. Menos trabalho tem sido efetivamente feito em doenças do envelhecimento onde mutações genéticas e estressores ambientais afetam o tecido que se desenvolveu normalmente. As doenças neurodegenerativas do envelhecimento podem ter herança genética complexa e contribuições de estressores ambientais que são inerentemente difíceis de modelar usando culturas de células de curto prazo. No entanto, em muitos casos, essas doenças complexas podem coalescer em estressores celulares ou metabólicos comuns que, quando testados em um tecido humano totalmente desenvolvido, podem fornecer informações poderosas sobre as doenças neurodegenerativas do envelhecimento8.
A doença degenerativa macular de início tardio, telangiectasia macular tipo II (MacTel), é um grande exemplo de uma doença neurodegenerativa geneticamente complexa que coalesce em um defeito metabólico comum. MacTel é uma doença degenerativa retiniana incomum do envelhecimento que resulta em perda de fotorreceptores e glia de Müller na mácula, levando a uma perda progressiva da visão central9,10,11,12,13. No MacTel, uma herança genética indeterminada, possivelmente multifatorial, conduz a uma redução comum da serina circulante nos pacientes, resultando em um aumento de uma espécie lipídica neurotóxica denominada desoxiesfingolipídios (deoxiSL)14,15. Para provar que o acúmulo de desoxisSL é tóxico para a retina e validar potenciais terapêuticas farmacêuticas, desenvolvemos este protocolo para avaliar a toxicidade de fotorreceptores em organoides da retina humana14.
Aqui delineamos um protocolo específico para diferenciar organoides da retina humana, estabelecer um ensaio de toxicidade e resgate usando organoides e quantificar os resultados. Fornecemos um exemplo bem-sucedido onde determinamos a toxicidade tecido-específica de um agente suspeito de causar doença, o deoxySL, e validamos o uso de um medicamento genérico seguro, o fenofibrato, para o tratamento potencial da toxicidade retiniana induzida pelo desoxySL. Trabalhos anteriores mostraram que o fenofibrato pode aumentar a degradação do desoxySL e diminuir o deoxySL circulante em pacientes, no entanto, sua eficácia em reduzir a toxicidade retiniana induzida pelo deoxySL não foi testada16,17. Embora apresentemos um exemplo específico, este protocolo pode ser utilizado para avaliar o efeito de qualquer número de estressores metabólicos/ambientais e potenciais drogas terapêuticas sobre o tecido retiniano.
Protocol
Representative Results
Discussion
Variações do protocolo de diferenciação
Desde a invenção das taças ópticas autoformadoras pelo grupo de YoshikiSasai20, muitos laboratórios desenvolveram protocolos para gerar organoides da retina que podem variar em quase todas as etapas5,18,19,21. Uma lista exaustiva de protocolos pode ser encontrada em Capowski et al.22</…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Apoiado pelo Lowy Medical Research Institute. Gostaríamos de agradecer à família Lowy por seu apoio ao projeto MacTel. Gostaríamos de agradecer a Mari Gantner, Mike Dorrell e Lea Scheppke por sua contribuição intelectual e assistência na preparação do manuscrito.
Materials
| 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| 125mL Erlenmeyer Flasks | VWR | 89095-258 | |
| 1-deoxysphinganine | Avanti | 860493 | |
| B27 Supplement, minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Beaver 6900 Mini-Blade | Beaver-Visitec | BEAVER6900 | |
| D-(+)-Sucrose | VWR | 97061-432 | |
| DAPI | Thermo-fisher | D1306 | |
| Dispase II, powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 11995073 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330 | |
| Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555 | Thermo-fisher | A32794 | |
| donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| FBS, Heat Inactivated | Corning | 45001-108 | |
| Fenofibrate | Sigma | F6020 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| Heparin | Stemcell Technologies | 7980 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin | Sigma | 11684795910 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356230 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| mTeSR 1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo-fisher | 28906 | |
| Rabbit anti-Recoverin antibody | Millipore | AB5585 | |
| Sodium Citrate | Sigma | W302600 | |
| Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units | MilliporeSigma | SE1M179M6 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| Tissue Plus- O.C.T. compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Tissue-Tek Cryomold | EMS | 62534-10 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Ultra-Low Attachment 6 well Plates | Corning | 29443-030 | |
| Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask | Corning | 3814 | |
| Vacuum Filtration System | VWR | 10040-436 | |
| Vectashield-mounting medium | vector Labs | H-1000 | |
| wax pen-ImmEdge | vector Labs | H-4000 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor) | Sigma | Y0503 |
Referências
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