Aqui apresentamos um protocolo passo-a-passo para gerar organoides humanos maduros da retina e utilizá-los em um ensaio de toxicidade de fotorreceptores para identificar candidatos farmacêuticos para a doença degenerativa retiniana relacionada à idade telangiectasia macular tipo 2 (MacTel).
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Artigo de método
Rastreios de toxicidade em organoides da retina humana para descoberta farmacêutica
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os organoides fornecem uma plataforma promissora para estudar o mecanismo e os tratamentos de doenças, diretamente no contexto do tecido humano com a versatilidade e rendimento da cultura celular. Organoides da retina humana madura são utilizados para rastrear potenciais tratamentos farmacêuticos para a doença degenerativa retiniana relacionada à idade telangiectasia macular tipo 2 (MacTel).
Recentemente, demonstramos que MacTel pode ser causado por níveis elevados de uma espécie lipídica atípica, os desoxiesfingolipídios (deoxySLs). Esses lipídios são tóxicos para a retina e podem conduzir a perda de fotorreceptores que ocorre em pacientes com MacTel. Para rastrear drogas quanto à sua capacidade de prevenir a toxicidade dos fotorreceptores desoxiSL, geramos organoides da retina humana a partir de uma linhagem de células-tronco pluripotentes (iPSC) não induzida por MacTel e os amadurecemos até uma idade pós-mitótica, onde eles desenvolvem todas as células derivadas da linhagem neuronal da retina, incluindo fotorreceptores funcionalmente maduros. Os organoides da retina foram tratados com um metabólito deoxySL e a apoptose foi medida dentro da camada fotorreceptora usando imunohistoquímica. Usando este modelo de toxicidade, compostos farmacológicos que previnem a morte dos fotorreceptores induzidos por desoxiSL foram triados. Usando uma abordagem candidata direcionada, determinamos que o fenofibrato, um medicamento comumente prescrito para o tratamento de colesterol e triglicérides elevados, também pode prevenir a toxicidade do desoxiSL nas células da retina.
A triagem de toxicidade identificou com sucesso uma droga aprovada pela FDA que pode prevenir a morte de fotorreceptores. Este é um achado diretamente acionável devido ao modelo altamente relevante para a doença testado. Esta plataforma pode ser facilmente modificada para testar qualquer número de estressores metabólicos e potenciais intervenções farmacológicas para futuras descobertas de tratamento em doenças da retina.
Introdução
A modelagem de doenças humanas em cultura de células e modelos animais tem fornecido ferramentas inestimáveis para a descoberta, modificação e validação de terapêuticas farmacológicas, permitindo que elas avancem de uma droga candidata para uma terapia aprovada. Embora uma combinação de modelos in vitro e in vivo não humanos tenha sido um componente crítico do pipeline de desenvolvimento de fármacos, eles frequentemente falham em prever o desempenho clínico de novos candidatos a fármacos1. Há uma clara necessidade de desenvolvimento de tecnologias que preencham a lacuna entre monoculturas celulares humanas simplistas e ensaios clínicos. Avanços....
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Protocolo
1. Descongelamento, passagem e expansão de iPSCs/ESCs
NOTA: Para todas as etapas de cultivo de células, use as práticas recomendadas para manter uma cultura de células estéril.
- Revestir uma placa de cultura celular de 6 poços com meio de matriz de membrana basal.
- Para preparar 1x deste meio, siga as especificações do produto ou dilua 75 μL de meio de matriz fria com 9 mL de DMEM/F12. Adicionar 1,5 mL de 1x meio recém-preparado por poço em uma placa de 6 poços. Incubar a 37 °C durante 30 min.
- Aspirar o meio da matriz da membrana basal e enxaguar cada poço com 3 mL de DMEM/F12. Adicionar 2 ml de DMEM/F12 e incubar ....
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Resultados
Os organoides da retina foram gerados a partir de uma linha iPSC não-controle MacTel. Após os organoides atingirem 26 semanas de cultura, eles foram selecionados e divididos em grupos experimentais. Os organoides foram tratados com concentrações variáveis de deoxySA para determinar se a desoxiSA é tóxica para fotorreceptores. Quatro concentrações de deoxySA foram testadas, de 0 a 1 μM (Figura 2) e organoides foram tratados por 8 dias, com trocas de meios a cada dois dias. A morte celular em .......
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Discussão
Variações do protocolo de diferenciação
Desde a invenção das taças ópticas autoformadoras pelo grupo de YoshikiSasai20, muitos laboratórios desenvolveram protocolos para gerar organoides da retina que podem variar em quase todas as etapas5,18,19,21. Uma lista exaustiva de protocolos pode ser encontrada em Capowski et al.22. O p.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse.
Agradecimentos
Apoiado pelo Lowy Medical Research Institute. Gostaríamos de agradecer à família Lowy por seu apoio ao projeto MacTel. Gostaríamos de agradecer a Mari Gantner, Mike Dorrell e Lea Scheppke por sua contribuição intelectual e assistência na preparação do manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,5 M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| 125mL Frascos Erlenmeyer | VWR | 89095-258 | |
| 1-desoxisfinanina | Avanti | 860493 | |
| B27 Suplemento, menos vitamina A | Gibco | 12587010 | |
| Beaver 6900 Mini-Blade | Beaver-Visitec | BEAVER6900 | |
| D-(+)-Sacarose | VWR | 97061-432 | |
| DAPI | Thermo-fisher | D1306 | |
| Dispase II, pó | Gibco | 17105041 | |
| DMEM, glicose alta, piruvato | Gibco | 11995073 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330 | |
| Ig-G anti-coelho de burro, Alexa Fluor plus 555 | Thermo-fisher | A32794 | |
| soro | de burroSigma | D9663-10ML | |
| FBS, Termo-inativado | Corning | 45001-108 | |
| Fenofibrato | Sigma | F6020 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| Stemcell Technologies | 7980 | ||
| , Fluorescina | Sigma | 11684795910 | |
| Matrigel, fator de crescimento reduzido | Corning | 356230 | |
| MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais | Gibco | 11140050 | |
| mTeSR 1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| N2 Suplemento | Gibco | 17502048 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15140122 | |
| Pierce 16% Formaldeído | Thermo-fisher | 28906 | |
| Coelho anti-Recoverina anticorpo | Millipore | AB5585 | |
| Citrato de sódio | Sigma | W302600 | |
| Steriflip Estéril unidades de filtro de vácuo descartáveis | MilliporeSigma | SE1M179M6 | |
| taurina | Sigma | T0625 | |
| Tecido Plus- OCT composto | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Tissue-Tek Cryomold | EMS | 62534-10 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Fixação Ultra-Baixa Placas de 6 poços | Corning | 29443-030 | |
| Fixação Ultra-Baixa 75cm2 U-Flask | Corning | 3814 | |
| Sistema de Filtração a Vácuo | VWR | 10040-436 | |
| Vectashield-montagem vetor médio | Labs | H-1000 | |
| caneta de cera-ImmEdge | vector Labs | H-4000 | |
| Y-27632 Dicloridrato (inibidor de rocha) | Sigma | Y0503 |
Referências
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J.
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Reimpressões e permissões
