Pruebas de toxicidad en organoides retinianos humanos para el descubrimiento farmacéutico
Summary
Aquí presentamos un protocolo paso a paso para generar organoides retinianos humanos maduros y utilizarlos en un ensayo de toxicidad de fotorreceptores para identificar candidatos farmacéuticos para la enfermedad degenerativa de la retina relacionada con la edad telangiectasia macular tipo 2 (MacTel).
Abstract
Los organoides proporcionan una plataforma prometedora para estudiar el mecanismo y los tratamientos de la enfermedad, directamente en el contexto del tejido humano con la versatilidad y el rendimiento del cultivo celular. Los organoides retinianos humanos maduros se utilizan para detectar posibles tratamientos farmacéuticos para la enfermedad degenerativa de la retina relacionada con la edad telangiectasia macular tipo 2 (MacTel).
Recientemente hemos demostrado que MacTel puede ser causado por niveles elevados de una especie lipídica atípica, los desoxiesfingolípidos (deoxySLs). Estos lípidos son tóxicos para la retina y pueden conducir a la pérdida de fotorreceptores que se produce en pacientes con MacTel. Para detectar la capacidad de los fármacos para prevenir la toxicidad de los fotorreceptores deoxySL, generamos organoides retinianos humanos a partir de una línea de células madre pluripotentes (iPSC) no inducida por MacTel y los maduramos hasta una edad postmitótica en la que desarrollan todas las células derivadas del linaje neuronal de la retina, incluidos los fotorreceptores funcionalmente maduros. Los organoides retinianos se trataron con un metabolito deoxySL y la apoptosis se midió dentro de la capa fotorreceptora mediante inmunohistoquímica. Utilizando este modelo de toxicidad, se examinaron compuestos farmacológicos que previenen la muerte de los fotorreceptores inducida por desoxiSL. Utilizando un enfoque de candidato dirigido, determinamos que el fenofibrato, un fármaco comúnmente prescrito para el tratamiento del colesterol alto y los triglicéridos, también puede prevenir la toxicidad del desoxiSL en las células de la retina.
La prueba de toxicidad identificó con éxito un medicamento aprobado por la FDA que puede prevenir la muerte de los fotorreceptores. Este es un hallazgo directamente procesable debido al modelo altamente relevante para la enfermedad probado. Esta plataforma se puede modificar fácilmente para probar cualquier número de factores estresantes metabólicos y posibles intervenciones farmacológicas para el futuro descubrimiento de tratamientos en enfermedades de la retina.
Introduction
El modelado de enfermedades humanas en cultivos celulares y modelos animales ha proporcionado herramientas invaluables para el descubrimiento, modificación y validación de terapias farmacológicas, lo que les permite avanzar del fármaco candidato a la terapia aprobada. Aunque una combinación de modelos in vitro y no humanos in vivo ha sido durante mucho tiempo un componente crítico de la línea de desarrollo de fármacos, con frecuencia no logran predecir el rendimiento clínico de los nuevos candidatos a fármacos1. Existe una clara necesidad de desarrollar tecnologías que cierren la brecha entre los monocultivos celulares humanos simplistas y los ensayos clínicos. Los recientes avances tecnológicos en cultivos de tejidos tridimensionales autoorganizados, los organoides, han mejorado su fidelidad a los tejidos que modelan, convirtiéndolos en herramientas prometedoras en la línea de desarrollo preclínicode fármacos 2.
Una ventaja importante del cultivo de células humanas sobre los modelos in vivo no humanos es la capacidad de replicar las complejidades específicas del metabolismo humano que pueden variar considerablemente incluso entre vertebrados de orden superior como humanos y ratones3. Sin embargo, esta especificidad puede verse eclipsada por una pérdida en la complejidad del tejido; Tal es el caso del tejido retiniano, donde múltiples tipos de células están intrincadamente entrelazadas y tienen una interacción metabólica simbiótica única entre subtipos celulares que no pueden replicarse en un monocultivo4. Los organoides humanos, que proporcionan un facsímil de tejidos humanos complejos con la accesibilidad y escalabilidad del cultivo celular, tienen el potencial de superar las deficiencias de estas plataformas de modelado de enfermedades.
Los organoides retinianos derivados de células madre han demostrado ser particularmente fieles en el modelado del complejo tejido de la retina neural humana5. Esto ha hecho del modelo organoide retiniano una tecnología prometedora para el estudio y tratamiento de la enfermedad retiniana 6,7. Hasta la fecha, gran parte del modelado de la enfermedad en organoides retinianos se ha centrado en enfermedades retinianas monogénicas donde los organoides retinianos se derivan de líneas iPSC con variantes genéticas causantes de enfermedades7. Estas son generalmente mutaciones altamente penetrantes que se manifiestan como fenotipos de desarrollo. Se ha realizado menos trabajo de manera efectiva en enfermedades del envejecimiento donde las mutaciones genéticas y los factores estresantes ambientales afectan el tejido que se ha desarrollado normalmente. Las enfermedades neurodegenerativas del envejecimiento pueden tener una herencia genética compleja y contribuciones de factores estresantes ambientales que son inherentemente difíciles de modelar utilizando cultivos celulares a corto plazo. Sin embargo, en muchos casos, estas enfermedades complejas pueden unirse en factores estresantes celulares o metabólicos comunes que, cuando se prueban en un tejido humano completamente desarrollado, pueden proporcionar información poderosa sobre las enfermedades neurodegenerativas del envejecimiento8.
La enfermedad degenerativa macular de inicio tardío, la telangiectasia macular tipo II (MacTel), es un gran ejemplo de una enfermedad neurodegenerativa genéticamente compleja que se fusiona en un defecto metabólico común. MacTel es una enfermedad degenerativa retiniana poco común del envejecimiento que resulta en la pérdida de fotorreceptores y glía de Müller en la mácula, lo que lleva a una pérdida progresiva en la visión central 9,10,11,12,13. En MacTel, una herencia genética indeterminada, posiblemente multifactorial, impulsa una reducción común de la serina circulante en los pacientes, lo que resulta en un aumento de una especie lipídica neurotóxica llamada desoxiesfingolípidos (deoxySL)14,15. Para probar que la acumulación de deoxySL es tóxica para la retina y validar posibles terapias farmacéuticas, desarrollamos este protocolo para evaluar la toxicidad de los fotorreceptores en organoides retinianos humanos14.
Aquí esbozamos un protocolo específico para diferenciar los organoides retinianos humanos, establecer un ensayo de toxicidad y rescate utilizando organoides y cuantificar los resultados. Proporcionamos un ejemplo exitoso en el que determinamos la toxicidad específica del tejido de un agente sospechoso de causar enfermedades, deoxySL, y validamos el uso de un medicamento genérico seguro, fenofibrato, para el tratamiento potencial de la toxicidad retiniana inducida por deoxySL. Trabajos previos han demostrado que el fenofibrato puede aumentar la degradación de deoxySL y disminuir el deoxySL circulante en pacientes, sin embargo, su eficacia en la reducción de la toxicidad retiniana inducida por deoxySL no ha sido probada16,17. Aunque presentamos un ejemplo específico, este protocolo se puede utilizar para evaluar el efecto de cualquier número de factores estresantes metabólicos / ambientales y posibles fármacos terapéuticos en el tejido de la retina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Variaciones del protocolo de diferenciación
Desde la invención de las copas ópticas autoformadas por el grupo20 de Yoshiki Sasai, muchos laboratorios han desarrollado protocolos para generar organoides retinianos que pueden variar en casi todos los pasos 5,18,19,21. Una lista exhaustiva de protocolos se puede encontrar en Capowski et <sup class="xr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Con el apoyo del Instituto de Investigación Médica Lowy. Nos gustaría agradecer a la familia Lowy por su apoyo al proyecto MacTel. Nos gustaría agradecer a Mari Gantner, Mike Dorrell y Lea Scheppke por su aporte intelectual y asistencia en la preparación del manuscrito.
Materials
| 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| 125mL Erlenmeyer Flasks | VWR | 89095-258 | |
| 1-deoxysphinganine | Avanti | 860493 | |
| B27 Supplement, minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Beaver 6900 Mini-Blade | Beaver-Visitec | BEAVER6900 | |
| D-(+)-Sucrose | VWR | 97061-432 | |
| DAPI | Thermo-fisher | D1306 | |
| Dispase II, powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 11995073 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330 | |
| Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555 | Thermo-fisher | A32794 | |
| donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| FBS, Heat Inactivated | Corning | 45001-108 | |
| Fenofibrate | Sigma | F6020 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| Heparin | Stemcell Technologies | 7980 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin | Sigma | 11684795910 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356230 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| mTeSR 1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo-fisher | 28906 | |
| Rabbit anti-Recoverin antibody | Millipore | AB5585 | |
| Sodium Citrate | Sigma | W302600 | |
| Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units | MilliporeSigma | SE1M179M6 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| Tissue Plus- O.C.T. compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Tissue-Tek Cryomold | EMS | 62534-10 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Ultra-Low Attachment 6 well Plates | Corning | 29443-030 | |
| Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask | Corning | 3814 | |
| Vacuum Filtration System | VWR | 10040-436 | |
| Vectashield-mounting medium | vector Labs | H-1000 | |
| wax pen-ImmEdge | vector Labs | H-4000 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor) | Sigma | Y0503 |
Referências
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