Toxicitetsskärmar i humana retinala organoider för farmaceutisk upptäckt
Summary
Här presenterar vi ett steg-för-steg-protokoll för att generera mogna humana retinala organoider och använda dem i en fotoreceptortoxicitetsanalys för att identifiera läkemedelskandidater för den åldersrelaterade retinala degenerativa sjukdomen makulär telangiektasi typ 2 (MacTel).
Abstract
Organoider ger en lovande plattform för att studera sjukdomsmekanism och behandlingar, direkt i samband med mänsklig vävnad med mångsidighet och genomströmning av cellodling. Mogna humana retinala organoider används för att screena potentiella farmaceutiska behandlingar för den åldersrelaterade retinala degenerativa sjukdomen makulat telangiektasi typ 2 (MacTel).
Vi har nyligen visat att MacTel kan orsakas av förhöjda nivåer av en atypisk lipidart, deoxisfingolipider (deoxySLs). Dessa lipider är giftiga för näthinnan och kan driva fotoreceptorförlusten som uppstår hos MacTel-patienter. För att screena läkemedel för deras förmåga att förhindra deoxySL-fotoreceptortoxicitet genererade vi humana retinala organoider från en icke-MacTel-inducerad pluripotent stamcellslinje (iPSC) och mognade dem till en postmitotisk ålder där de utvecklar alla neuronala härstamningshärledda celler i näthinnan, inklusive funktionellt mogna fotoreceptorer. De retinala organoiderna behandlades med en deoxySL-metabolit och apoptos mättes inom fotoreceptorskiktet med användning av immunhistokemi. Med hjälp av denna toxicitetsmodell screenades farmakologiska föreningar som förhindrar deoxySL-inducerad fotoreceptordöd. Med hjälp av en riktad kandidatmetod bestämde vi att fenofibrat, ett läkemedel som vanligtvis föreskrivs för behandling av högt kolesterol och triglycerider, också kan förhindra deoxySL-toxicitet i näthinnans celler.
Toxicitetsskärmen identifierade framgångsrikt ett FDA-godkänt läkemedel som kan förhindra fotoreceptordöd. Detta är ett direkt angripbart resultat på grund av den mycket sjukdomsrelevanta modellen som testats. Denna plattform kan enkelt modifieras för att testa valfritt antal metaboliska stressfaktorer och potentiella farmakologiska ingrepp för framtida behandlingsupptäckt i näthinnesjukdomar.
Introduction
Modellering av mänskliga sjukdomar i cellodling och djurmodeller har gett ovärderliga verktyg för upptäckt, modifiering och validering av farmakologiska terapier, vilket gör det möjligt för dem att gå vidare från läkemedelskandidat till godkänd terapi. Även om en kombination av in vitro- och icke-humana in vivo-modeller länge har varit en kritisk komponent i läkemedelsutvecklingspipelinen, misslyckas de ofta med att förutsäga den kliniska prestandan hos nya läkemedelskandidater1. Det finns ett tydligt behov av att utveckla teknik som överbryggar klyftan mellan förenklade humana cellulära monokulturer och kliniska prövningar. De senaste tekniska framstegen inom självorganiserade tredimensionella vävnadskulturer, organoider, har förbättrat deras trohet mot vävnaderna de modellerar vilket gör dem lovande verktyg i den prekliniska läkemedelsutvecklingspipeline2.
En stor fördel med human cellodling jämfört med icke-humana in vivo-modeller är förmågan att replikera de specifika komplikationerna i mänsklig metabolism som kan variera avsevärt även mellan ryggradsdjur av högre ordning som människor och möss3. Denna specificitet kan emellertid överskuggas av en förlust i vävnadskomplexitet; Så är fallet för retinal vävnad där flera celltyper är intrikat sammanvävda och har ett unikt symbiotiskt metaboliskt samspel mellan cellulära subtyper som inte kan replikeras i en monokultur4. Mänskliga organoider, som tillhandahåller en faksimil av komplexa mänskliga vävnader med tillgänglighet och skalbarhet för cellodling, har potential att övervinna bristerna i dessa sjukdomsmodelleringsplattformar.
Retinala organoider härrörande från stamceller har visat sig vara särskilt trogna när det gäller att modellera den komplexa vävnaden i den mänskliga neurala näthinnan5. Detta har gjort retinal organoidmodell till en lovande teknik för studier och behandling av retinal sjukdom 6,7. Hittills har mycket av sjukdomsmodelleringen i retinala organoider fokuserat på monogena retinala sjukdomar där retinala organoider härrör från iPSC-linjer med sjukdomsframkallande genetiska varianter7. Dessa är i allmänhet mycket penetrerande mutationer som manifesterar sig som utvecklingsfenotyper. Mindre arbete har effektivt gjorts på åldrande sjukdomar där genetiska mutationer och miljöstressorer påverkar vävnad som har utvecklats normalt. Neurodegenerativa åldrande sjukdomar kan ha komplexa genetiska arv och bidrag från miljöstressorer som i sig är svåra att modellera med hjälp av kortvariga cellkulturer. Men i många fall kan dessa komplexa sjukdomar sammanfalla på vanliga cellulära eller metaboliska stressfaktorer som, när de testas på en fullt utvecklad mänsklig vävnad, kan ge kraftfulla insikter i neurodegenerativa sjukdomar i åldrande8.
Den sena debuterande makuladegenerativa sjukdomen, makulat telangiektasi typ II (MacTel), är ett bra exempel på en genetiskt komplex neurodegenerativ sjukdom som sammanfaller på en gemensam metabolisk defekt. MacTel är en ovanlig retinal degenerativ åldringssjukdom som resulterar i fotoreceptor och Müller glia förlust i makula, vilket leder till en progressiv förlust i central vision 9,10,11,12,13. I MacTel driver ett obestämt, möjligen multifaktoriellt, genetiskt arv en vanlig minskning av cirkulerande serin hos patienter, vilket resulterar i en ökning av en neurotoxisk lipidart som kallas deoxisfingolipider (deoxySL) 14,15. För att bevisa att ackumulering av deoxySL är giftigt för näthinnan och för att validera potentiella farmaceutiska terapier utvecklade vi detta protokoll för att analysera fotoreceptortoxicitet i humana retinala organoider14.
Här skisserar vi ett specifikt protokoll för att differentiera humana retinala organoider, upprätta en toxicitets- och räddningsanalys med hjälp av organoider och kvantifiera resultat. Vi ger ett framgångsrikt exempel där vi bestämmer den vävnadsspecifika toxiciteten hos ett misstänkt sjukdomsframkallande medel, deoxySL, och validerar användningen av ett säkert generiskt läkemedel, fenofibrat, för potentiell behandling av deoxySL-inducerad retinal toxicitet. Tidigare arbete har visat att fenofibrat kan öka nedbrytningen av deoxySL och sänka cirkulerande deoxySL hos patienter, men dess effektivitet för att minska deoxySL-inducerad retinal toxicitet har inte testats16,17. Även om vi presenterar ett specifikt exempel kan detta protokoll användas för att utvärdera effekten av valfritt antal metabola / miljömässiga stressorer och potentiella terapeutiska läkemedel på retinal vävnad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Variationer i differentieringsprotokoll
Sedan uppfinningen av självbildande optiska koppar av Yoshiki Sasais grupp20 har många laboratorier utvecklat protokoll för att generera retinala organoider som kan variera vid nästan varje steg 5,18,19,21. En uttömmande förteckning över protokoll finns i Capowski m.fl.22. Differen…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Med stöd av Lowy Medical Research Institute. Vi vill tacka familjen Lowy för deras stöd till MacTel-projektet. Vi vill tacka Mari Gantner, Mike Dorrell och Lea Scheppke för deras intellektuella bidrag och hjälp med att förbereda manuskriptet.
Materials
| 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| 125mL Erlenmeyer Flasks | VWR | 89095-258 | |
| 1-deoxysphinganine | Avanti | 860493 | |
| B27 Supplement, minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Beaver 6900 Mini-Blade | Beaver-Visitec | BEAVER6900 | |
| D-(+)-Sucrose | VWR | 97061-432 | |
| DAPI | Thermo-fisher | D1306 | |
| Dispase II, powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 11995073 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330 | |
| Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555 | Thermo-fisher | A32794 | |
| donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| FBS, Heat Inactivated | Corning | 45001-108 | |
| Fenofibrate | Sigma | F6020 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| Heparin | Stemcell Technologies | 7980 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin | Sigma | 11684795910 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356230 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| mTeSR 1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo-fisher | 28906 | |
| Rabbit anti-Recoverin antibody | Millipore | AB5585 | |
| Sodium Citrate | Sigma | W302600 | |
| Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units | MilliporeSigma | SE1M179M6 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| Tissue Plus- O.C.T. compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Tissue-Tek Cryomold | EMS | 62534-10 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Ultra-Low Attachment 6 well Plates | Corning | 29443-030 | |
| Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask | Corning | 3814 | |
| Vacuum Filtration System | VWR | 10040-436 | |
| Vectashield-mounting medium | vector Labs | H-1000 | |
| wax pen-ImmEdge | vector Labs | H-4000 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor) | Sigma | Y0503 |
Referências
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J. Engineered tissues and strategies to overcome challenges in drug development. Advances in Drug Delivery Reviews. 158, 116-139 (2020).
- Demetrius, L. Of mice and men. When it comes to studying ageing and the means to slow it down, mice are not just small humans. EMBO Reports. , 39-44 (2005).
- Lindsay, K. J., et al. Pyruvate kinase and aspartate-glutamate carrier distributions reveal key metabolic links between neurons and glia in retina. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111 (43), 15579-15584 (2014).
- Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
- Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
- Sinha, D., Phillips, J., Phillips, M. J., Gamm, D. M. Mimicking retinal development and disease with human pluripotent stem cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (5), 1-9 (2016).
- Gan, L., Cookson, M. R., Petrucelli, L., La Spada, A. R. Converging pathways in neurodegeneration, from genetics to mechanisms. Nature Neuroscience. 21 (10), 1300-1309 (2018).
- Aung, K. Z., Wickremasinghe, S. S., Makeyeva, G., Robman, L., Guymer, R. H. The prevalence estimates of macular telangiectasia type 2: the Melbourne collaborative cohort study. Retina. 30 (3), 473-478 (2010).
- Chew, E. Y., et al. Effect of ciliary neurotrophic factor on retinal neurodegeneration in patients with macular telangiectasia type 2: A randomized clinical trial. Ophthalmology. 126 (4), 540-549 (2019).
- Gass, J. D., Blodi, B. A. Idiopathic juxtafoveolar retinal telangiectasis. Update of classification and follow-up study. Ophthalmology. 100 (10), 1536-1546 (1993).
- Klein, R., et al. The prevalence of macular telangiectasia type 2 in the Beaver Dam eye study. American Journal of Ophthalmology. 150 (1), 55-62 (2010).
- Powner, M. B., et al. Loss of Muller’s cells and photoreceptors in macular telangiectasia type 2. Ophthalmology. 120 (11), 2344-2352 (2013).
- Gantner, M. L., et al. Serine and lipid metabolism in macular disease and peripheral neuropathy. New England Journal of Medicine. 381 (15), 1422-1433 (2019).
- Scerri, T. S., et al. Genome-wide analyses identify common variants associated with macular telangiectasia type 2. Nature Genetics. 49 (4), 559-567 (2017).
- Alecu, I., et al. Cytotoxic 1-deoxysphingolipids are metabolized by a cytochrome P450-dependent pathway. Journal of Lipid Research. 58 (1), 60-71 (2017).
- Othman, A., et al. Fenofibrate lowers atypical sphingolipids in plasma of dyslipidemic patients: A novel approach for treating diabetic neuropathy. Journal of Clinical Lipidology. 9 (4), 568-575 (2015).
- Ohlemacher, S. K., Iglesias, C. L., Sridhar, A., Gamm, D. M., Meyer, J. S. Generation of highly enriched populations of optic vesicle-like retinal cells from human pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 32, 1-20 (2015).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communication. 5, 4047 (2014).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Science Reports. 7 (1), 766 (2017).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
- Luo, Z., et al. An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation. Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).
- Ovando-Roche, P., et al. Use of bioreactors for culturing human retinal organoids improves photoreceptor yields. Stem Cell Research Therapy. 9 (1), 156 (2018).
