Farmasötik Keşif için İnsan Retinal Organoidlerinde Toksisite Taramaları
Summary
Burada, olgun insan retinal organoidleri üretmek ve bunları yaşa bağlı retinal dejeneratif hastalık maküler telanjiektazi tip 2 (MacTel) için farmasötik adayları tanımlamak için bir fotoreseptör toksisite testinde kullanmak için adım adım bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Organoidler, hücre kültürünün çok yönlülüğü ve verimi ile doğrudan insan dokusu bağlamında hastalık mekanizmasını ve tedavilerini incelemek için umut verici bir platform sağlar. Olgun insan retinal organoidleri, yaşa bağlı retinal dejeneratif hastalık maküler telanjiektazi tip 2 (MacTel) için potansiyel farmasötik tedavileri taramak için kullanılır.
Son zamanlarda MacTel’in atipik bir lipit türü olan deoksisfingolipidlerin (deoksiSL’ler) yüksek seviyelerinden kaynaklanabileceğini gösterdik. Bu lipitler retina için toksiktir ve MacTel hastalarında meydana gelen fotoreseptör kaybına neden olabilir. İlaçları deoksiSL fotoreseptör toksisitesini önleme yetenekleri açısından taramak için, MacTel kaynaklı olmayan bir pluripotent kök hücre (iPSC) hattından insan retinal organoidleri ürettik ve bunları fonksiyonel olarak olgun fotoreseptörler de dahil olmak üzere retinanın tüm nöronal soy türevi hücrelerini geliştirdikleri mitotik bir yaşa olgunlaştırdık. Retinal organoidler deoksiSL metaboliti ile tedavi edildi ve immünohistokimya kullanılarak fotoreseptör tabaka içinde apoptoz ölçüldü. Bu toksisite modeli kullanılarak, deoksiSL kaynaklı fotoreseptör ölümünü önleyen farmakolojik bileşikler tarandı. Hedeflenen bir aday yaklaşım kullanarak, yüksek kolesterol ve trigliseritlerin tedavisi için yaygın olarak reçete edilen bir ilaç olan fenofibratın, retina hücrelerinde deoksiSL toksisitesini de önleyebileceğini belirledik.
Toksisite taraması, fotoreseptör ölümünü önleyebilen FDA onaylı bir ilacı başarıyla tanımladı. Bu, test edilen hastalıkla ilgili yüksek model nedeniyle doğrudan eyleme geçirilebilir bir bulgudur. Bu platform, retina hastalıklarında gelecekteki tedavi keşfi için herhangi bir sayıda metabolik stresörü ve potansiyel farmakolojik müdahaleleri test etmek için kolayca değiştirilebilir.
Introduction
İnsan hastalığının hücre kültüründe ve hayvan modellerinde modellenmesi, farmakolojik terapötiklerin keşfi, modifikasyonu ve doğrulanması için paha biçilmez araçlar sağlamış ve aday ilaçtan onaylanmış tedaviye ilerlemelerini sağlamıştır. İn vitro ve insan dışı in vivo modellerin bir kombinasyonu uzun zamandır ilaç geliştirme boru hattının kritik bir bileşeni olmasına rağmen, yeni ilaç adaylarının klinik performansını tahmin etmekte sıklıkla başarısız olmaktadırlar1. Basit insan hücresel monokültürleri ile klinik çalışmalar arasındaki boşluğu dolduran teknolojilerin geliştirilmesine açık bir ihtiyaç vardır. Kendi kendini organize eden üç boyutlu doku kültürleri, organoidlerdeki son teknolojik gelişmeler, modelledikleri dokulara sadakatlerini geliştirmiş ve onları klinik öncesi ilaç geliştirme boru hattında umut verici araçlar haline getirmiştir2.
İnsan hücre kültürünün insan olmayan in vivo modellere göre en büyük avantajı, insanlar ve fareler gibi daha yüksek dereceli omurgalılar arasında bile önemli ölçüde değişebilen insan metabolizmasının spesifik karmaşıklıklarını çoğaltma yeteneğidir3. Bununla birlikte, bu özgüllük, doku karmaşıklığındaki bir kayıpla gölgelenebilir; Çoklu hücre tiplerinin karmaşık bir şekilde iç içe geçtiği ve bir monokültürde çoğaltılamayan hücresel alt tipler arasında benzersiz bir simbiyotik metabolik etkileşime sahip olduğu retina dokusu için de durum böyledir4. Hücre kültürünün erişilebilirliği ve ölçeklenebilirliği ile karmaşık insan dokularının bir faksını sağlayan insan organoidleri, bu hastalık modelleme platformlarının eksikliklerinin üstesinden gelme potansiyeline sahiptir.
Kök hücrelerden elde edilen retinal organoidlerin, insan nöral retinasının karmaşık dokusunun modellenmesinde özellikle sadık olduğu kanıtlanmıştır5. Bu, retinal organoid modelini retina hastalığının araştırılması ve tedavisi için umut verici bir teknoloji haline getirmiştir 6,7. Bugüne kadar retinal organoidlerdeki hastalık modellemesinin çoğu, retinal organoidlerin hastalığa neden olan genetik varyantlara sahip iPSC hatlarından türetildiği monogenik retinal hastalıklara odaklanmıştır7. Bunlar genellikle gelişimsel fenotipler olarak ortaya çıkan oldukça penetrant mutasyonlardır. Genetik mutasyonların ve çevresel stresörlerin normal olarak gelişen dokuyu etkilediği yaşlanan hastalıklar üzerinde etkili bir şekilde daha az çalışma yapılmıştır. Yaşlanmanın nörodejeneratif hastalıkları, karmaşık genetik mirasa ve kısa süreli hücre kültürleri kullanılarak modellenmesi doğal olarak zor olan çevresel stresörlerin katkılarına sahip olabilir. Bununla birlikte, birçok durumda, bu karmaşık hastalıklar, tamamen gelişmiş bir insan dokusu üzerinde test edildiğinde, 8 yaşın nörodejeneratif hastalıklarına güçlü bilgiler sağlayabilen ortak hücresel veya metabolik stresörler üzerinde birleşebilir.
Geç başlangıçlı maküler dejeneratif hastalık olan maküler telanjiektazi tip II (MacTel), yaygın bir metabolik defekt üzerinde birleşen genetik olarak karmaşık bir nörodejeneratif hastalığın harika bir örneğidir. MacTel, makulada fotoreseptör ve Müller glia kaybı ile sonuçlanan, merkezi görmedeilerleyici bir kayba yol açan nadir görülen retinal dejeneratif bir yaşlanma hastalığıdır 9,10,11,12,13. MacTel’de, belirlenmemiş, muhtemelen çok faktörlü, genetik bir kalıtım, hastalarda dolaşımdaki serinde ortak bir azalmaya neden olur ve bu da deoksisfengolipitler (deoksiSL) adı verilen nörotoksik bir lipit türünde artışa neden olur14,15. DeoksiSL birikiminin retina için toksik olduğunu kanıtlamak ve potansiyel farmasötik terapötikleri doğrulamak için, insan retinal organoidlerinde fotoreseptör toksisitesini test etmek için bu protokolü geliştirdik14.
Burada, insan retinal organoidlerini ayırt etmek, organoidleri kullanarak bir toksisite ve kurtarma testi oluşturmak ve sonuçları ölçmek için özel bir protokolün ana hatlarını çiziyoruz. Şüpheli bir hastalığa neden olan ajan olan deoksiSL’nin dokuya özgü toksisitesini belirlediğimiz ve deoksiSL kaynaklı retina toksisitesinin potansiyel tedavisi için güvenli bir jenerik ilaç olan fenofibratın kullanımını doğruladığımız başarılı bir örnek sunuyoruz. Önceki çalışmalar, fenofibratın hastalarda deoksiSL’nin bozulmasını artırabileceğini ve dolaşımdaki deoksiSL’yi azaltabileceğini göstermiştir, ancak deoksiSL’ye bağlı retina toksisitesini azaltmadaki etkinliği test edilmemiştir16,17. Her ne kadar spesifik bir örnek sunsak da, bu protokol herhangi bir sayıda metabolik/çevresel stresörün ve potansiyel terapötik ilaçların retina dokusu üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Farklılaştırma protokolü varyasyonları
Yoshiki Sasai’nin grup 20 tarafından kendi kendini oluşturan optik kapların icadından bu yana, birçok laboratuvar neredeyse her adımdadeğişebilen retinal organoidler üretmek için protokoller geliştirmiştir 5,18,19,21. Protokollerin ayrıntılı bir listesi Capowski ve ark.22’de<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lowy Tıbbi Araştırma Enstitüsü tarafından desteklenmektedir. MacTel projesine verdikleri destek için Lowy ailesine teşekkür ederiz. Mari Gantner, Mike Dorrell ve Lea Scheppke’ye entelektüel katkıları ve makalenin hazırlanmasındaki yardımları için teşekkür ederiz.
Materials
| 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| 125mL Erlenmeyer Flasks | VWR | 89095-258 | |
| 1-deoxysphinganine | Avanti | 860493 | |
| B27 Supplement, minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Beaver 6900 Mini-Blade | Beaver-Visitec | BEAVER6900 | |
| D-(+)-Sucrose | VWR | 97061-432 | |
| DAPI | Thermo-fisher | D1306 | |
| Dispase II, powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 11995073 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330 | |
| Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555 | Thermo-fisher | A32794 | |
| donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| FBS, Heat Inactivated | Corning | 45001-108 | |
| Fenofibrate | Sigma | F6020 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| Heparin | Stemcell Technologies | 7980 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin | Sigma | 11684795910 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356230 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| mTeSR 1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo-fisher | 28906 | |
| Rabbit anti-Recoverin antibody | Millipore | AB5585 | |
| Sodium Citrate | Sigma | W302600 | |
| Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units | MilliporeSigma | SE1M179M6 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| Tissue Plus- O.C.T. compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Tissue-Tek Cryomold | EMS | 62534-10 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Ultra-Low Attachment 6 well Plates | Corning | 29443-030 | |
| Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask | Corning | 3814 | |
| Vacuum Filtration System | VWR | 10040-436 | |
| Vectashield-mounting medium | vector Labs | H-1000 | |
| wax pen-ImmEdge | vector Labs | H-4000 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor) | Sigma | Y0503 |
Referências
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J. Engineered tissues and strategies to overcome challenges in drug development. Advances in Drug Delivery Reviews. 158, 116-139 (2020).
- Demetrius, L. Of mice and men. When it comes to studying ageing and the means to slow it down, mice are not just small humans. EMBO Reports. , 39-44 (2005).
- Lindsay, K. J., et al. Pyruvate kinase and aspartate-glutamate carrier distributions reveal key metabolic links between neurons and glia in retina. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111 (43), 15579-15584 (2014).
- Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
- Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
- Sinha, D., Phillips, J., Phillips, M. J., Gamm, D. M. Mimicking retinal development and disease with human pluripotent stem cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (5), 1-9 (2016).
- Gan, L., Cookson, M. R., Petrucelli, L., La Spada, A. R. Converging pathways in neurodegeneration, from genetics to mechanisms. Nature Neuroscience. 21 (10), 1300-1309 (2018).
- Aung, K. Z., Wickremasinghe, S. S., Makeyeva, G., Robman, L., Guymer, R. H. The prevalence estimates of macular telangiectasia type 2: the Melbourne collaborative cohort study. Retina. 30 (3), 473-478 (2010).
- Chew, E. Y., et al. Effect of ciliary neurotrophic factor on retinal neurodegeneration in patients with macular telangiectasia type 2: A randomized clinical trial. Ophthalmology. 126 (4), 540-549 (2019).
- Gass, J. D., Blodi, B. A. Idiopathic juxtafoveolar retinal telangiectasis. Update of classification and follow-up study. Ophthalmology. 100 (10), 1536-1546 (1993).
- Klein, R., et al. The prevalence of macular telangiectasia type 2 in the Beaver Dam eye study. American Journal of Ophthalmology. 150 (1), 55-62 (2010).
- Powner, M. B., et al. Loss of Muller’s cells and photoreceptors in macular telangiectasia type 2. Ophthalmology. 120 (11), 2344-2352 (2013).
- Gantner, M. L., et al. Serine and lipid metabolism in macular disease and peripheral neuropathy. New England Journal of Medicine. 381 (15), 1422-1433 (2019).
- Scerri, T. S., et al. Genome-wide analyses identify common variants associated with macular telangiectasia type 2. Nature Genetics. 49 (4), 559-567 (2017).
- Alecu, I., et al. Cytotoxic 1-deoxysphingolipids are metabolized by a cytochrome P450-dependent pathway. Journal of Lipid Research. 58 (1), 60-71 (2017).
- Othman, A., et al. Fenofibrate lowers atypical sphingolipids in plasma of dyslipidemic patients: A novel approach for treating diabetic neuropathy. Journal of Clinical Lipidology. 9 (4), 568-575 (2015).
- Ohlemacher, S. K., Iglesias, C. L., Sridhar, A., Gamm, D. M., Meyer, J. S. Generation of highly enriched populations of optic vesicle-like retinal cells from human pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 32, 1-20 (2015).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communication. 5, 4047 (2014).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Science Reports. 7 (1), 766 (2017).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
- Luo, Z., et al. An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation. Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).
- Ovando-Roche, P., et al. Use of bioreactors for culturing human retinal organoids improves photoreceptor yields. Stem Cell Research Therapy. 9 (1), 156 (2018).
