यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल स्पॉटिटन, एक उपन्यास रोबोटिक प्रणाली के उपयोग का वर्णन करता है, जो एक आत्म-बाती, नैनोवायर ग्रिड पर ब्याज के दो नमूने वितरित करता है जो तरल क्रायोजेन में विट्रीफिकेशन से पहले न्यूनतम 90 एमएस के लिए मिश्रण करता है।
दो या अधिक बातचीत कणों की शुरुआती मुठभेड़ से शुरू होने वाले अल्पकालिक आणविक राज्यों का कब्जा क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) के क्षेत्र में बहुत रुचि की एक प्रयोगात्मक चुनौती बनी हुई है। कुछ पद्धतिगत रणनीतियां विकसित की गई हैं जो इन “समय-हल” अध्ययनों का समर्थन करती हैं, जिनमें से एक, स्पॉटिटन-एक उपन्यास रोबोटिक सिस्टम- सटीक लौकिक और स्थानिक नियंत्रण के साथ पिकालिएटर आकार के नमूना बूंदों के वितरण को जोड़ती है। समय-हल किए गए स्पॉटिटन वर्कफ़्लो न्यूनतम नमूना मात्रा से प्रारंभिक संरचनात्मक पुनर्व्यवस्थाओं से पूछताछ करने के लिए एक विशिष्ट कुशल दृष्टिकोण प्रदान करता है। स्वतंत्र रूप से नियंत्रित पीजोइलेक्ट्रिक डिस्पेंसर, दो नमूनों की भूमि से निकाल दिया गया और एक नैनोवायर ईएम ग्रिड पर तेजी से मिश्रण किया क्योंकि यह क्रायोजन की ओर गिरता है। संभावित रूप से सैकड़ों ग्रिड एक नमूने के केवल कुछ माइक्रोलीटर से तेजी से उत्तराधिकार में तैयार किए जा सकते हैं। यहां, स्पॉटिटन सिस्टम के संचालन का एक विस्तृत चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल ग्रिड तैयारी के दौरान उत्पन्न होने वाली विशिष्ट समस्याओं के निवारण पर ध्यान केंद्रित करने के साथ प्रस्तुत किया गया है।
क्रायो-ईएम को पकड़ने और उप-दूसरे टाइमस्केल (समय-हल क्रायो-ईएम) पर प्रोटीन की क्षणिक अनुरूप राज्यों को प्रकट करने की क्षमता कई समूहों द्वारा महसूस की गई है, जिसकी शुरुआत बेरिमन और अनविन1 से हुई है, जिसकी तकनीक क्रायो-ईएमएस ग्रिड2तैयार करने के लिए डबोशेट द्वारा विकसित मानक डुबकी ठंड विधि पर बनाई गई थी। उन्होंने क्रायोजेन कप के ठीक ऊपर एक परमाणु जोड़ा जिसने कंप्रेस्ड नाइट्रोजन गैस का उपयोग एक दूसरे नमूने की एक अच्छी धुंध को एक जल्दी से आगे बढ़नेवाला ईएम ग्रिड पर स्प्रे करने के लिए किया, जिसमें पहला नमूना था जिसे लागू किया गया था और एक पतली जलीय परत पर दाग दिया गया था। हालांकि इस प्रणाली के रूप में 1 एमएस के रूप में कम के रूप में मिश्रण समय प्राप्त कर सकता है, यह अभी भी उपयोगकर्ता द्वारा पहले नमूने के मैनुअल दाग की मांग की-एक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण कार्य-और दूसरे नमूने की एक अपेक्षाकृत उच्च मात्रा । इसके अलावा, व्यवहार में, यह जानना मुश्किल था कि दोनों नमूनों का मिश्रण कहां हुआ था, मिश्रित नमूने में एक प्रत्ययी मार्कर के रूप में फेरिटिन नैनोकणों के उपयोग की आवश्यकता होती है। हावर्ड व्हाइट और सहकर्मियों के बाद के प्रयासों ने दाग के कंप्यूटर नियंत्रण को शामिल करके और चरण3,4को छिड़ककर इस छिड़काव-मिश्रण दृष्टिकोण के नियंत्रण और प्रजनन क्षमता में सुधार किया । यह पता लगाने के लिए कि नमूने कितनी अच्छीतरह से और कहां मिश्रण करते हैं, एक ही समूह 5 और अन्य6,7,8,9,10 एक मिश्रण-छिड़काव दृष्टिकोण11 में स्थानांतरित हो गए हैं जिसमें दो नमूने या तो सिरिंज पंपों के दबाव में संकीर्ण केशिका ट्यूबों में या नाइट्रोजन गैस द्वारा संचालित माइक्रोफैब्रिकेटेड, माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स में मिश्रित हैं । ये प्रीमिक्सिंग सिस्टम न केवल पूर्ण मिश्रण सुनिश्चित करते हैं, बल्कि समय-हल किए गए अध्ययनों के समाधान को बढ़ाने के लिए मिश्रण समय की ठीक ट्यूनिंग को भी सक्षम करते हैं।
स्पॉटिटन सिस्टम में ईएम ग्रिड में नमूना लागू करने के लिए एक वैकल्पिक तरीके के रूप में पीजोइलेक्ट्रिक डिस्पेंसर की शुरुआत ने नमूना जमाव के सटीक लक्ष्यीकरण और ग्रिड12बनाने के लिए बहुत छोटे नमूना मात्रा की आवश्यकता दोनों को सक्षम किया। बाद में, नैनोवायर ग्रिड और रूट नमूना आवेदन (“ऑन-द-फ्लाई” स्पॉटिंग) के उपयोग ने एक ब्लॉटिंग चरण की आवश्यकता को हटा दिया और13,14बार आवेदन-टू-विट्रीफिकेशन बार कम कर दिया। समय के लिए नए दृष्टिकोण के लिए हल क्रायो-EM यहां वर्णित है, आवश्यक नियंत्रण हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर उंनयन के साथ एक दूसरे मशीन Spotiton प्रणाली में जोड़ा गया था एक चलती नैनोवायर ग्रिड पर एक दूसरे नमूने की डिलीवरी सक्षम करने के लिए लगभग तुरंत पहले15के बयान के बाद । दो ओवरलैपिंग नमूने ग्रिड पर मिश्रण करते हैं क्योंकि वे विट्रिफिकेशन से पहले नैनोवायर द्वारा एक पतली जलीय परत में दुष्ट होते हैं। 90 एमएस के रूप में कम समय के रूप में मिश्रण प्राप्त किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य व्यावहारिक जानकारी प्रदान करना है कि पीजोइलेक्ट्रिक डिस्पेंसिंग और नैनोवायर ग्रिड का उपयोग करके समय-हल किए गए प्रयोगों का संचालन कैसे किया जाए। इसके अतिरिक्त, चूंकि उपयोग, स्थिरता और थ्रूपुट में आसानी बढ़ाने के लिए हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर को संशोधित किया जा रहा है, इसलिए यह प्रोटोकॉल पहले से सूचित विधि15के अप-टू-डेट विवरण के रूप में भी कार्य करता है।
यह प्रोटोकॉल क्रायो-ईएम इमेजिंग के लिए ग्रिड तैयार करने के लिए स्पॉटिटन रोबोटिक सिस्टम के उपयोग को रेखांकित करता है जो दो नमूने ले जाते हैं, आम तौर पर ब्याज का प्रोटीन और एक सक्रिय लिगांड, जिसे 90-500 एमएस के लिए मिलाया गया है। हालांकि कार्यप्रवाह सीधा है, वहां कुछ विचार उपयोगकर्ता को ध्यान में रखना चाहिए एक उत्पादक ग्रिड बनाने सत्र सुनिश्चित करने के लिए कर रहे हैं । सबसे पहले, यह फायरिंग से रोकने के लिए भरा या अवरुद्ध बनने के लिए पीजोइलेक्ट्रिक डिस्पेंसर युक्तियों में से एक के लिए असामान्य नहीं है। इस तरह की विफलता के परिणामस्वरूप एक तरल धारी होगी, जो ऊपरी या निचले कैमरे से छवि कैप्चर पर देखी जाती है, जो दोनों युक्तियों के बाद देखी गई तुलना में संकरा दिख रहा है। एक रुकावट टिप में एक हवा बुलबुला आवास से परिणाम सकता है, बूंद गठन में खलल न डालें, या प्रोटीन नमूना है कि बाहर सूख गया है और संकीर्ण टिप छिद्र सील से । हालांकि एस्पिरेटेड नमूना इस प्रक्रिया में खो जाता है, दोनों समस्याओं को सुझावों के अल्ट्रासोनिक वॉश और नमूने की फिर से आकांक्षा द्वारा हल किया जा सकता है। बाद में clogging और नमूना अपशिष्ट को रोकने के लिए, यह अच्छी तरह से प्रधानमंत्री (फ्लश) नमूना आकांक्षा से पहले तरल पदार्थ लाइनों के लिए महत्वपूर्ण है और कक्ष और कफन के भीतर एक उच्च और लगातार आर्द्रता के स्तर को बनाए रखने के लिए । इसके अतिरिक्त, एक विशेष रूप से उच्च एकाग्रता के साथ एक प्रोटीन नमूना अच्छी तरह से बनाए रखा आर्द्रता के बावजूद टिप फायरिंग को प्रभावित कर सकते हैं । हालांकि निरीक्षण टैब पर फायरिंग आयाम बढ़ाने आंशिक रूप से उच्च प्रोटीन एकाग्रता के कारण कमजोर गोलीबारी के लिए क्षतिपूर्ति कर सकते हैं, नमूना कमजोर कम से 1:2 टिप फायरिंग में सुधार होगा और clogging से बचने के ।
दूसरा, लक्षित मिश्रण अवधि के लिए इष्टतम मोटाई की बर्फ उत्पन्न करने के लिए आवश्यक आदर्श बाती गति को प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है। आम तौर पर, तेजी से मिश्रण समय तेजी से बाती की आवश्यकता होगी, धीमी मिश्रण समय धीमी बाती की आवश्यकता होती है। आदर्श रूप से दुष्ट ग्रिड के लिए, ऊपरी कैमरे की छवि में एक तरल धारी स्पष्ट रूप से स्पष्ट रूप से समझ में आती है, जबकि निचले कैमरे में, धारी के स्थान में ग्रिड सलाखों का केवल एक बहुत मामूली मोटा दिखाई देता है। धीमी गति से बाती, कम कैमरा छवि पर एक काले धारी द्वारा संकेत दिया, आम तौर पर बर्फ है कि इमेजिंग के लिए बहुत मोटी है छोड़ देता है । या तो छवि पर एक धारी की अनुपस्थिति तेजी से बाती है कि छेद में कोई पानी छोड़ दिया हो सकता है इंगित करताहै (चित्रा S5)। नैनोवायर घनत्व, प्लाज्मा सफाई सेटिंग्स और अवधि जैसे कई कारक, और कक्ष आर्द्रता के जोखिम और सेट स्तर का समय बाती गति को प्रभावित कर सकता है। खराब (धीमी गति से) बाती ग्रिड पर नैनोवायर की विरल कोटिंग का परिणाम हो सकता है। नैनोवायर समाधान16के संपर्क में आने के समय को थोड़ा कमजोर और बढ़ाकर, ग्रिड बार पर नैनोवायर के घनत्व और कवरेज में वृद्धि होगी, जिससे तेजी से बाती की सुविधा मिलेगी। यदि नैनोवायर घनत्व पर्याप्त है, तो प्लाज्मा की सफाई की वाट सेटिंग या अवधि में वृद्धि से भी बाती में सुधार होगा। यहां अनुशंसित सेटिंग्स अपेक्षाकृत कम शक्ति और लंबी अवधि के हैं, लेकिन यदि आवश्यक हो तो बदला जा सकता है।
हालांकि, यदि ग्रिड और प्लाज्मा सफाई सेटिंग्स के दोनों विशिष्ट बैच ने पूर्व सत्र में अच्छी तरह से काम किया है, तो स्लो बाती प्रदर्शन नैनोवायर्स के अत्यधिक जोखिम से कक्ष के भीतर उच्च आर्द्रता तक उत्पन्न हो सकता है, जिससे नमी और कम तरल-होल्डिंग क्षमता के साथ उनकी संतृप्ति हो सकती है। कक्ष आर्द्रता के ग्रिड-संतृप्त प्रभाव को या तो चिमटी बढ़ते और ग्रिड के बीच बीता हुआ समय को कम करके कम किया जा सकता है या डुबकी से पहले सिस्टम आर्द्रता स्तर को कम किया जा सकता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि बाद में संबंधित जोखिम लाता है कि प्रोटीन नमूने से भरी हुई टिप रोकना होगा। इस जोखिम को ऑफसेट करने के लिए, कफन में युक्तियों को धारण करें जहां उच्च आर्द्रता स्तर बनाए रखा जाता है, चिमटी को एक नया ग्रिड रखने के लिए समय की स्वीकार्य मात्रा में वृद्धि कर सकता है। अंत में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एक कम डुबकी समय (ग्रिड त्वरण और/या अधिकतम वेग में वृद्धि से प्राप्त) वास्तव में ग्रिड की बाती विशेषताओं को बदलने के बिना पतली बर्फ के साथ ग्रिड में परिणाम कर सकते हैं । हालांकि, के रूप में दो नमूनों के मिश्रण समय भी कम हो जाएगा, डुबकी समय एक कारक है कि आम तौर पर धीमी गति से बाती पता बदल जाता है नहीं है । बाती है कि बहुत तेजी से है पता करने के लिए, बर्फ है कि या तो बहुत पतली या ग्रिड छेद में अनुपस्थित है में जिसके परिणामस्वरूप, ऊपर उल्लिखित उपायों के विपरीत लिया जा सकता है ।
स्पॉटिटन कुछ फायदे और नुकसान प्रस्तुत करता है जब सबसेकंड समय-हल अध्ययनों के लिए विकसित अन्य तकनीकों की तुलना में। चूंकि मिश्रित नमूना धारी में प्रत्येक डिस्पेंसर से केवल 2-4 एनएम तरल होता है, इसलिए प्रत्येक नमूने का एक 3 μL aliquot कई ग्रिड तैयार करने के लिए पर्याप्त है- नमूना सीमित होने पर एक महत्वपूर्ण लाभ। इसके अतिरिक्त, एकीकृत कैमरों का उपयोग कर नमूना बयान का अवलोकन, हालांकि स्पॉटिटन17के लिए पूरी तरह से अद्वितीय नहीं है, अन्य मिश्रण उपकरणों की एक विशेषता नहीं है और गिर ग्रिड एक कच्चे तेल के पास के अधीन होने की अनुमति देता है/ सिस्टम का एक प्रमुख नुकसान 90 एमएस का न्यूनतम मिश्रण समय है, जो यांत्रिक घटकों की भौतिक सीमाओं द्वारा प्रतिबंधित है, जो तेजी से जैविक प्रतिक्रियाओं से पूछताछ को पहुंच से बाहर रखता है। तुलना करके, मौजूदा माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम पर नियमित रूप से 10 एमएस से कम समय हासिल किया जाता है। Spotiton आधारित पर, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध गिरगिट प्रणाली, डिजाइन और निर्माण सुधार ५४ एमएस के लिए ंयूनतम डुबकी समय कम कर दिया है और संभावना है कि एक दूसरे मशीन के अलावा तेजी से मिश्रण समय की अनुमति दे सकता है से Spotiton वर्तमान में पेशकश कर सकते हैं ।
आज तक, स्पॉटिटन का उपयोग करके जल्दी, अल्पकालिक आणविक राज्यों की जांच करने के लिए प्रयोगों की एक श्रृंखला आयोजित की गई है, जिसमें 70 के दशक के राइबोसोम की असेंबली, ट्रांसमेम्ब्रान आयन चैनल में कैल्शियम-ट्रिगर अनुरूप परिवर्तन, और जीटीपी हाइड्रोलिसिस15के जवाब में डायनामिन का संकीर्तन शामिल है। इन परिणामों के प्रकाशन के बाद से, स्पॉटिटन ग्रिड बनाने वाले सत्रों की थ्रूपुट, प्रजनन क्षमता और रिपोर्टिंग को बढ़ाने के लिए सिस्टम में कई बदलाव शामिल किए गए हैं। इनमें अन्य लोगों के अलावा, ड्यूल-जोन, स्वचालित आर्द्रता-निगरानी और नियंत्रण प्रणाली, प्रयोग दर्शक सुविधा, साइड-बाय-साइड टिप निरीक्षण सुविधा, और यूआई में कई मामूली अपग्रेड शामिल हैं। उन्नत प्रणाली बेहतर भविष्य दो नमूना मिश्रण उन पहले रिपोर्ट के रूप में के रूप में अच्छी तरह से तेजी से बाध्यकारी परख जैसे एक छोटे अणु चिकित्सकीय और उसके प्रोटीन लक्ष्य या यहां तक कि एंटीबॉडी-एंटीजन जटिल गठन के बीच के समान प्रयोगों का समर्थन करेंगे । जबकि वर्तमान और भविष्य के समय-दो बातचीत भागीदारों को शामिल प्रयोगों निश्चित रूप से जारी रहेगा, एक तिहाई piezoelectric मशीन और संबद्ध हार्डवेयर के अलावा और संभावित प्रयोगों की सीमा को व्यापक कर सकता है । उदाहरण के लिए, ब्याज के प्रोटीन के बाद डिटर्जेंट का प्रारंभिक जमाव, इसके बाद बातचीत या सक्रिय लिगामेंट डिटर्जेंट के विस्तारित जोखिम के किसी भी संभावित नकारात्मक प्रभाव को हटा सकता है, अक्सर पसंदीदा अभिविन्यास जैसे आम उप-कीटनाशक इमेजिंग परिणामों को रोकने के लिए आवश्यक होता है। पहले से प्रकाशित काम और संभावित भविष्य के अनुप्रयोगों दोनों के प्रकाश में, स्पॉटिटन क्रायो-ईएम समुदाय के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है ताकि सबसेकंड समय-हल किए गए अध्ययनों के संचालन को सुविधाजनक बनाया जा सके।
The authors have nothing to disclose.
हम प्रारंभिक डिजाइन और Spotiton प्रणाली के बाद के विकास के लिए इंजीनियरिंग कला LLC (एरिजोना, संयुक्त राज्य अमेरिका) में पीटर ए क्हान और टेरी Rohde शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम मदद और तकनीकी सहायता के लिए न्यूयॉर्क स्ट्रक्चरल बायोलॉजी सेंटर में सिमंस इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सेंटर के कर्मचारियों को धन्यवाद देते हैं। यहां प्रस्तुत किया गया काम न्यूयॉर्क स्ट्रक्चरल बायोलॉजी सेंटर में स्थित नेशनल रिसोर्स फॉर ऑटोमेटेड मॉलिक्यूलर माइक्रोस्कोपी में आयोजित किया गया था, जो एनआईएच (GM103310) और सिमंस फाउंडेशन (SF349247) के अनुदानों द्वारा समर्थित था।
Buffer | N/A | N/A | |
cryogenic grid storage boxes | EMS (Hatfield, PA; USA) | N/A | |
Cu/Rh 300 mesh EM grids | EMS (Hatfield, PA; USA) | EMS300-Cu-Rh | treated to coat with nanowires as previously described (Wei et al, 2018) |
ethane gas | TW Smith Corp. (Brooklyn, NY; USA) | N/A | |
Grid-handling forceps | EMS (Hatfield, PA; USA) | 78320-5B | |
liquid nitrogen | Airgas, Inc. (Radnor, PA; USA) | N/A | |
liquid nitrogen reservoir with brass ethane cup (from FEI Vitrobot) | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA; USA) | ||
Picosystem | Hydro System and Supplies (Durham, NC; USA) | N/A | water purification system |
Protein/other sample | N/A | N/A | |
Solarus 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. (Pleasanton, CA; USA) | N/A |