भेड़ में वयस्क और प्रीपुबर्टल अंडाशय से एकत्र इन विट्रो परिपक्व ओसाइट्स का विट्रीफिकेशन
Summary
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य वयस्क और किशोर भेड़ ओसाइट्स के विट्रीफिकेशन के लिए एक मानक विधि प्रदान करना है । इसमें इन विट्रो परिपक्वता मीडिया की तैयारी से लेकर पोस्ट वार्मिंग कल्चर तक के सभी कदम शामिल हैं । न्यूनतम आवश्यक मात्रा सुनिश्चित करने के लिए क्रायोटॉप का उपयोग करके एमआईआई चरण में ओसाइट्स को विट्रीप किया जाता है।
Abstract
पशुधन में, इन विट्रो भ्रूण उत्पादन प्रणालियों को विकसित किया जा सकता है और बड़ी संख्या में अंडाशय और ओसाइट्स के लिए निरंतर धन्यवाद किया जा सकता है जिन्हें कसाईघर से आसानी से प्राप्त किया जा सकता है। वयस्क अंडाशय हमेशा कई अंत्येक्षक सहन करते हैं, जबकि पूर्व-प्यूबर्टल दानदाताओं में ओसाइट्स की अधिकतम संख्या 4 सप्ताह की उम्र में उपलब्ध होती है, जब अंडाशय एंट्राल रोम की पीक संख्या सहन करते हैं। इस प्रकार, 4 सप्ताह पुराने भेड़ के बच्चे को अच्छा दानदाता माना जाता है, भले ही प्रीपुबर्टल ओसाइट्स की विकासात्मक क्षमता उनके वयस्क समकक्ष की तुलना में कम हो।
बुनियादी अनुसंधान और वाणिज्यिक अनुप्रयोगों को वयस्क और प्रीपुबर्टल दोनों दानदाताओं से प्राप्त विट्रीफाइड ओसाइट्स को सफलतापूर्वक क्रायोप्रेरिजर्विंग की संभावना से बढ़ावा मिलेगा। प्रीपुबर्टल दानदाताओं से एकत्र ओसाइट के विट्रीफिकेशन से भी पीढ़ी के अंतराल को छोटा करने की अनुमति मिलेगी और इस प्रकार प्रजनन कार्यक्रमों में आनुवंशिक लाभ बढ़ जाएगा । हालांकि, क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद विकास की क्षमता का नुकसान स्तनधारी ओसाइट्स को शायद क्रायोप्रिजर्व के लिए सबसे कठिन सेल प्रकारों में से एक बनाता है। उपलब्ध क्रायोप्रिजर्वेशन तकनीकों में, विट्रीफिकेशन को पशु और मानव ओसाइट्स पर व्यापक रूप से लागू किया जाता है। तकनीक में हाल की प्रगति के बावजूद, क्रायोप्रोटेक्टिव एजेंटों की उच्च सांद्रता के साथ-साथ हल्का चोट और ओस्मोटिक तनाव अभी भी कई संरचनात्मक और आणविक परिवर्तन को प्रेरित करता है और स्तनधारी ओसाइट्स की विकासात्मक क्षमता को कम करता है। यहां, हम किशोर और वयस्क दानदाताओं से एकत्र भेड़ oocytes के विट्रीफिकेशन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और क्रायोप्रिजर्वेशन से पहले विट्रो में परिपक्व हो जाते हैं। प्रोटोकॉल में ओसाइट इन विट्रो परिपक्वता से लेकर विट्रीफिकेशन, वार्मिंग और पोस्ट-वार्मिंग इनक्यूबेशन अवधि तक सभी प्रक्रियाएं शामिल हैं । Oocytes vitrified MII चरण में वास्तव में वार्मिंग के बाद निषेचित किया जा सकता है, लेकिन वे अतिरिक्त समय की जरूरत है निषेचन से पहले क्रायोप्रिजर्वेशन प्रक्रियाओं के कारण नुकसान को बहाल करने और उनके विकास की क्षमता में वृद्धि करने के लिए । इस प्रकार, वार्मिंग के बाद संस्कृति की स्थिति और समय oocyte विकास क्षमता की बहाली के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं, खासकर जब oocyte किशोर दाताओं से एकत्र कर रहे हैं ।
Introduction
मादा गेमेस का दीर्घकालिक भंडारण अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला प्रदान कर सकता है, जैसे आनुवंशिक चयन कार्यक्रमों द्वारा घरेलू पशु प्रजनन में सुधार, पूर्व-सीटू वन्यजीव प्रजातियों के संरक्षण कार्यक्रम के माध्यम से जैव विविधता को संरक्षित करने में योगदान देना, और विट्रो जैव प्रौद्योगिकी अनुसंधान और अनुप्रयोगों में बढ़ाना विट्रो भ्रूण उत्पादन या परमाणु प्रत्यारोपण कार्यक्रमों में शामिल किए जाने के लिए धन्यवाद1,2,3। प्रजनन कार्यक्रमों में पीढ़ी के अंतराल को छोटा करके किशोर ओसाइट विट्रीफिकेशन से आनुवंशिक लाभ में भी वृद्धि होगी। अल्ट्रा-रैपिड कूलिंग और ओसाइट्स के वार्मिंग द्वारा विट्रीफिकेशन वर्तमान में पशुधन ओसाइट्स क्रायोप्रिजर्वेशन 5 के लिए एक मानक दृष्टिकोण मानाजाताहै। जुगाली करने वालों में, विट्रीफिकेशन से पहले, ऑसाइटो-व्युत्पन्न अंडाशय2से प्राप्त रोम से पुनः प्राप्ति के बाद, ओसाइट्स आमतौर पर विट्रो में परिपक्व होते हैं। वयस्क, और विशेष रूप से प्रीप्बर्टल अंडाशय4,6,वास्तव में क्रायोप्रीडेड होने के लिए लगभग असीमित संख्या में ओसाइट्स की आपूर्ति कर सकते हैं।
पशुओं में, ओसाइट विट्रीफिकेशन और वार्मिंग के बाद, पिछले दशक3के दौरान कई प्रयोगशालाओं द्वारा आमतौर पर >10% पर ब्लास्टोसिस्ट पैदावार की सूचना दी गई है। हालांकि, छोटे जुगाली में ओसाइट विट्रीफिकेशन अभी भी किशोर और वयस्क दोनों ऊसाइट्स के लिए अपेक्षाकृत नया माना जाता है, और भेड़ ओसाइट विट्रीफिकेशन के लिए एक मानक विधि2,5 स्थापितकी जानी बाकी है। हाल की प्रगति के बावजूद, विट्रीफाइड और गर्म ओसाइट वास्तव में कई कार्यात्मक और संरचनात्मक परिवर्तन प्रस्तुत करता है जो उनकी विकासात्मक क्षमता7,8,9को सीमित करता है। इस प्रकार, कुछ लेखों में विट्रिफाइड/गर्म भेड़ ओसाइट्स2में 10% या उससे अधिक पर ब्लास्टोसिस्ट विकास की सूचना दी गई है । उपर्युक्त परिवर्तनों को कम करने के लिए कई दृष्टिकोणों की जांच की गई है: विट्रीफिकेशन और विगलन समाधानों की संरचना का अनुकूलन10,11; विभिन्न क्रायो-उपकरणों के उपयोग के साथ प्रयोगकरना 8,12,13; और इन विट्रो परिपक्वता(आईवीएम)4, 14,15 और/
यहां हम किशोर और वयस्क दानदाताओं से एकत्र भेड़ oocytes के विट्रीफिकेशन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और क्रायोप्रिजर्वेशन से पहले विट्रो में परिपक्व हो जाते हैं। प्रोटोकॉल में ओसाइट इन विट्रो परिपक्वता से लेकर विट्रीफिकेशन, वार्मिंग और पोस्ट-वार्मिंग कल्चर पीरियड तक सभी प्रक्रियाएं शामिल हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
घरेलू जानवरों में Oocyte क्रायोप्रिजर्वेशन न केवल महिला आनुवंशिक संसाधनों के दीर्घकालिक संरक्षण की अनुमति दे सकता है, बल्कि भ्रूणीय जैव प्रौद्योगिकी के विकास को भी आगे बढ़ा सकता है। इस प्रकार, ओसाइट विट?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को इस काम के लिए कोई विशिष्ट धन प्राप्त नहीं हुआ । प्रोफेसर मारिया ग्रेजिया कपपाई और डॉ वेलेरिया पास्सियू को वीडियो वॉयसओवर के लिए और वीडियो बनाने के दौरान लैब स्थापित करने के लिए कृतज्ञता से स्वीकार किया जाता है ।
Materials
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| Albumin bovine fraction V, protease free | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| Calcium chloride (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)Trehalose dehydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Egg yolk | Sigma-Aldrich | P3556 | |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G5638 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4149 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
| Inverted microscope | Diaphot, Nikon | ||
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A3784 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A4534 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| L-Cystine | Sigma-Aldrich | C8786 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H9511 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7383 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L1512 | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L1137 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M2893 | |
| L-Ornithine | Sigma-Aldrich | O6503 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5030 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P4655 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l. | ||
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| New born calf serum heat inactivated (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium dl-lactate solution syrup | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sperm Class Analyzer | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| Statistical software Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
| Stereo microscope | Olimpus | SZ61 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
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