Een eenvoudige en flexibele inentingsmethode voor het nauwkeurig beoordelen van echte meeldauw-infectie fenotypen van Arabidopsis en andere planten
Summary
We presenteren een protocol voor het bouwen van een eenvoudig sporenverdelingssysteem bestaande uit een inentingsdoos met een gaas van ~ 50 μm en een transparante plastic kamer. Dit kan worden gebruikt om planten gelijkmatig in te enten met echte meeldauwsporen, waardoor een nauwkeurige en reproduceerbare beoordeling van ziektefenotypen van bestudeerde planten mogelijk wordt.
Abstract
Het verminderen van gewasverliezen als gevolg van schimmelziekten vereist een beter begrip van de mechanismen die de immuniteit van planten en schimmelpathogenese regelen, wat op zijn beurt een nauwkeurige bepaling van ziektefenotypen van planten vereist bij infectie met een bepaalde schimmelpathogeen. Nauwkeurige ziektefenotypering met niet-culturele biotrofe schimmelpathogenen zoals echte meeldauw is echter niet gemakkelijk te bereiken en kan een snelheidsbeperkende stap van een onderzoeksproject zijn. Hier hebben we een veilig, efficiënt en gemakkelijk te bedienen ziektefenotyperingssysteem ontwikkeld met de Arabidopsis-echte meeldauwinteractie als voorbeeld. Dit systeem bestaat voornamelijk uit drie componenten: (i) een houten inentingsdoos uitgerust met een afneembaar deksel gemonteerd met een roestvrijstalen of nylon gaas van ~ 50 μm poriën voor het inenten van een flat van planten met schimmelsporen, (ii) een transparante plastic kamer met een kleine opening aan de voorkant voor het minimaliseren van sporenvlucht tijdens het uitvoeren van inenting binnenin, en (iii) een sporenontwrichtende en distributiemethode voor gelijkmatige en effectieve inenting. De hier beschreven protocollen omvatten de stappen en parameters voor het maken van de inentingsdoos en de plastic kamer tegen lage kosten, en een videodemonstratie van hoe het systeem te gebruiken om zelfs inenting met echte meeldauwsporen mogelijk te maken, waardoor de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van ziektefenotypering wordt verbeterd.
Introduction
Echte meeldauw is een van de meest voorkomende en belangrijke ziekten van talrijke voedselgewassen en sierplanten1. Studies naar echte meeldauwziekten zijn erg populair, zoals blijkt uit meer dan 10.500 publicaties als zoekresultaat met “echte meeldauw” als sleutelwoord op het Web of Science (vanaf november 2020). Inderdaad, echte meeldauw (vertegenwoordigd door Blumeria graminis) wordt beschouwd als een van de top 10 schimmelpathogenen door het journal of Molecular Plant Pathology2. Kwantificering van ziektegevoeligheid is een noodzakelijke stap in de karakterisering van plantengenen die bijdragen aan ziekteresistentie of gevoeligheid, of functionele identificatie van kandidaat-effectorgenen in echte meeldauw. Betrouwbare ziektefenotypering is echter veel uitdagender met echte meeldauw in vergelijking met die met de meeste andere schimmelpathogenen, deels omdat, in tegenstelling tot sporen van de laatste, sporen van echte meeldauwsoorten (zoals Golovinomyces cichoracearum UCSC1 op basis van onze laboratoriumervaring) een verminderde levensvatbaarheid vertonen na het doorlopen van een watersuspensieproces 3,4 . Ontoereikende en/of ongelijke inenting van testplanten met een bepaald echte meeldauwpathogeen kan leiden tot onnauwkeurige fenotyperingsresultaten.
Een aantal inentingsmethoden werden gerapporteerd voor echte meeldauwstudies. Deze omvatten (i) het borstelen van sporen rechtstreeks van geïnfecteerde bladeren om planten te testen5, (ii) het spuiten van een sporensuspensie om planten te testen6, (iii) het blazen van sporen met behulp van een vacuümbewerkte bezinktoren naar planten op de bodem van de toren7, en (iv) sporenafgifte door het combinatorische gebruik van een nylon gaasmembraan en op geluid gebaseerde trillingen8 . De methode voor het borstelen (of afstoffen) van sporen is gemakkelijk uit te voeren, maar ongelijk van aard, dus het is mogelijk niet nauwkeurig voor kwantitatieve beoordeling. Sporenspuiten is handig en gelijkmatig, maar zoals hierboven vermeld, kan dit leiden tot een slechte sporenkieming4. De laatste twee (d.w.z. iii-iv) zijn sterk verbeterde methoden die in staat zijn om zelfs inenting te bereiken; beide zijn echter niet flexibel in het aanpassen van hun inentingscapaciteit in termen van het aantal planten dat in één gebeurtenis moet worden ingeënt, waardoor beide apparaten niet triviaal zijn en hun werking beperkt is tot laboratoriumgebieden waar een vacuüm- en / of elektriciteitsbron is.
Ons lab werkt al meer dan 20 jaar met plant-echte meeldauw interactie 9,10. In het afgelopen decennium hebben we een aantal inentingsmethoden getest en onlangs een eenvoudige en toch effectieve echte meeldauwinentingsmethode ontwikkeld. Deze op mesh gebaseerde sporenborstelmethode kan zorgen voor een gelijkmatige inenting en is eenvoudig en schaalbaar, dus moet gemakkelijk worden overgenomen door elk laboratorium dat met echte meeldauw werkt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Onze meshed-box-gebaseerde inentingsmethode heeft verschillende voordelen ten opzichte van andere inentingsmethoden. Ten eerste kan het een gelijkmatige verdeling van sporen bereiken als het op de juiste manier wordt gebruikt, zoals aangetoond in figuur 5. Ten tweede kan het gebruik van ~ 50 μm mesh, plus sporenontwrichting door zacht schudden van geïnfecteerde bladeren, planteninfectie door trips of andere plant-infecterende insecten die aanwezig zijn in bronplanten verminderen. Ten derde…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk werd ondersteund door de National Science Foundation (IOS-1901566) aan S. Xiao. De auteurs willen F. Coker en C. Hooks bedanken voor het onderhoud van de plantengroeifaciliteit en Jorge Zamora voor technische hulp bij de fabricage van de inentingsdoos en -kamer.
Materials
| 48 µm stainless steel grid mesh screen; Size: 24" X 48" | Amazon | NA | For making the lid of an inoculation box |
| #6-32 x ¾" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32 zinc plated nylon lock nut (4-Pack) | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32×3/8” Phillips flat head machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing magnet door catch plates |
| #8-32×1/2" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing corner braces and door hinge |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 17 ½" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 30" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 20" X 29 ½ " | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 1-5/8" cabinet door magnetic catch white | Home Depot | Model #P110-W | For making an inoculation chamber |
| 2" steel zinc-plated corner brace (8-Pack) | Home Depot | Model #13611 | For making an inoculation box & chamber |
| 3" Corner Clamp | Harbor Freight Tools | SKU 63653, 1852, 60589 | For making inoculation chamber |
| 3/4" steel zinc plated corner brace (4-Pack) | Home Depot | Model #13542 | For making an inoculation box & chamber |
| 4-7/8" zinc-plated light duty door pull handles | Home Depot | Model #15184 | For making an inoculation box |
| Fine fan-blender brushes | Michaels Store | M10472846 | For inoculation |
| Kelleher 3/4" x 3/4" x 36" wood square dowel | Home Depot | NA | For making the lid of an inoculation box |
| Medium density fiberboard (1/4" x 2' x 4'); | Home Depot | Model# 1508104 | For making an inoculation box |
| Round glass coverslips with a 500 µm grid | ibidi USA Inc. | 10816 | For determining spore density |
Referências
- Huckelhoven, R., Panstruga, R. Cell bi ology of the plant-powdery mildew interaction. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 738-746 (2011).
- Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Sakurai, H., Hirata, K. Some observations on the relation between the penetration hypha and haustorium of barley powdery mildew and host cell. V. Influence of water spray on the pathogen and host tissue. Annual Phytopathology Society of Japan. 24, 239-245 (1959).
- Shomari, S. H., Kennedy, R. Survival of Oidium anacardii on cashew (Anacardium occidentale) in southern Tanzania. Plant Pathology. 48 (4), 505-513 (1999).
- Sitterly, W. R., Spencer, D. M. . Powdery Mildews. , 369 (1978).
- Reuveni, M., Agapov, V., Reuveni, R. Induction of systemic resistance to powdery mildew and growth increase in cucumber by phosphates. Biological Agriculture & Horticulture. 9 (4), 305-315 (1993).
- Reifschneider, F. J. B., Boiteux, L. S. A vacuum-operated settling tower for inoculation of powdery mildew fungi. Phytopathology. 78 (11), 1463-1465 (1988).
- Chowdhury, A., Bremer, G. B., Salt, D. W., Miller, P., Ford, M. G. A novel method of delivering Blumeria graminis f. sp hordei spores for laboratory experiments. Crop Protection. 22 (7), 917-922 (2003).
- Xiao, S., et al. Broad-spectrum mildew resistance in Arabidopsis thaliana mediated by RPW8. Science. 291 (5501), 118-120 (2001).
- Xiao, S., Ellwood, S., Findlay, K., Oliver, R. P., Turner, J. G. Characterization of three loci controlling resistance of Arabidopsis thaliana accession Ms-0 to two powdery mildew diseases. The Plant Journal. 12 (4), 757-768 (1997).
- Reuber, T. L., et al. Correlation of defense gene induction defects with powdery mildew susceptibility in Arabidopsis enhanced disease susceptibility mutants. The Plant Journal. 16 (4), 473-485 (1998).
- Xiao, S., et al. The atypical resistance gene, RPW8, recruits components of basal defence for powdery mildew resistance in Arabidopsis. The Plant Journal. 42 (1), 95-110 (2005).
