Un metodo di inoculazione semplice e flessibile per valutare accuratamente i fenotipi di infezione da oidio di Arabidopsis e altre piante
Summary
Presentiamo un protocollo per la costruzione di un semplice sistema di distribuzione delle spore costituito da una scatola di inoculazione con una maglia di ~ 50 μm e una camera di plastica trasparente. Questo può essere utilizzato per inoculare uniformemente le piante con spore di oidio, consentendo così una valutazione accurata e riproducibile dei fenotipi di malattia delle piante in studio.
Abstract
Ridurre le perdite di raccolto dovute a malattie fungine richiede una migliore comprensione dei meccanismi che regolano l’immunità delle piante e la patogenesi fungina, che a sua volta richiede una determinazione accurata dei fenotipi di malattia delle piante in seguito all’infezione con un particolare agente patogeno fungino. Tuttavia, un’accurata fenotipizzazione della malattia con patogeni fungini biotrofici non coltivabili come l’oidio non è facile da raggiungere e può essere un passo limitante di un progetto di ricerca. Qui, abbiamo sviluppato un sistema di fenotipizzazione della malattia sicuro, efficiente e facile da usare utilizzando l’interazione Arabidopsis-oidio come esempio. Questo sistema consiste principalmente di tre componenti: (i) una scatola di inoculazione in legno dotata di un coperchio rimovibile montato con una rete in acciaio inossidabile o nylon di ~ 50 μm pori per inoculare un piatto di piante con spore fungine, (ii) una camera di plastica trasparente con una piccola apertura frontale per ridurre al minimo la fuoriuscita di spore durante l’inoculazione all’interno, e iii) un metodo di rimozione e distribuzione delle spore per un’inoculazione uniforme ed efficace. I protocolli qui descritti includono i passaggi e i parametri per realizzare la scatola di inoculazione e la camera di plastica a basso costo e una dimostrazione video di come utilizzare il sistema per consentire l’inoculazione uniforme con spore di oidio, migliorando così l’accuratezza e la riproducibilità della fenotipizzazione della malattia.
Introduction
L’oidio è una delle malattie più comuni e importanti di numerose colture alimentari e piante ornamentali1. Gli studi sulle malattie dell’oidio sono stati molto popolari, come evidenziato da oltre 10.500 pubblicazioni come risultato della ricerca con “oidio” come parola chiave sul Web of Science (a partire da novembre 2020). Infatti, l’oidio (rappresentato da Blumeria graminis) è considerato uno dei primi 10 patogeni fungini dalla rivista Molecular Plant Pathology2. La quantificazione della suscettibilità alla malattia è un passo necessario nella caratterizzazione dei geni vegetali che contribuiscono alla resistenza o alla suscettibilità alle malattie, o nell’identificazione funzionale di geni effettori candidati nell’oidio. Tuttavia, la fenotipizzazione affidabile della malattia è molto più difficile con l’oidio rispetto a quella con la maggior parte degli altri patogeni fungini, in parte perché, a differenza delle spore di questi ultimi, le spore di specie di oidio (come Golovinomyces cichoracearum UCSC1 sulla base della nostra esperienza di laboratorio) mostrano una ridotta vitalità dopo aver attraversato un processo di sospensione dell’acqua 3,4 . L’inoculazione inadeguata e/o irregolare delle piante di prova con un particolare patogeno dell’oidio può portare a risultati di fenotipizzazione imprecisi.
Sono stati riportati diversi metodi di inoculazione per studi sull’oidio. Questi includono (i) spazzolare le spore direttamente dalle foglie infette alle piante di prova5, (ii) spruzzare una sospensione di spore per testare le piante6, (iii) soffiare spore usando una torre di decantazione azionata a vuoto alle piante sul fondo della torre7 e (iv) consegna di spore mediante l’uso combinatorio di una membrana a rete di nylon e vibrazioni basate sul suono8 . Il metodo di spazzolatura delle spore (o spolveratura) è facile da eseguire ma di natura irregolare, quindi potrebbe non essere accurato per la valutazione quantitativa. La spruzzatura di spore è conveniente e uniforme, ma come detto sopra può causare una scarsa germinazione delle spore4. Gli ultimi due (cioè iii-iv) sono metodi molto migliorati in grado di raggiungere anche l’inoculazione; Tuttavia, entrambi non sono flessibili nel regolare la loro capacità di inoculazione in termini di numero di piante da inoculare in un singolo evento, rendendo entrambi gli apparecchi non banali, e il loro funzionamento è limitato alle aree di laboratorio dove c’è un vuoto e / o una fonte di elettricità.
Il nostro laboratorio lavora con l’interazione pianta-oidio da oltre 20 anni 9,10. Negli ultimi dieci anni, abbiamo testato una serie di metodi di inoculazione e recentemente abbiamo sviluppato un metodo di inoculazione dell’oidio semplice ma efficace. Questo metodo di spazzolatura delle spore a rete può garantire un’inoculazione uniforme ed è semplice e scalabile, quindi dovrebbe essere facilmente adottato da qualsiasi laboratorio che lavora con l’oidio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il nostro metodo di inoculazione basato su mesh-box presenta diversi vantaggi rispetto ad altri metodi di inoculazione. In primo luogo, può raggiungere una distribuzione uniforme delle spore se utilizzato correttamente, come dimostrato nella Figura 5. In secondo luogo, l’uso di ~ 50 μm di mesh, oltre allo spostamento delle spore mediante un leggero scuotimento delle foglie infette, può ridurre l’infezione delle piante da tripidi o altri insetti che infettano le piante presenti nelle piant…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation (IOS-1901566) a S. Xiao. Gli autori desiderano ringraziare F. Coker e C. Hooks per la manutenzione dell’impianto di crescita delle piante e Jorge Zamora per l’aiuto tecnico associato alla fabbricazione della scatola e della camera di inoculazione.
Materials
| 48 µm stainless steel grid mesh screen; Size: 24" X 48" | Amazon | NA | For making the lid of an inoculation box |
| #6-32 x ¾" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32 zinc plated nylon lock nut (4-Pack) | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32×3/8” Phillips flat head machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing magnet door catch plates |
| #8-32×1/2" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing corner braces and door hinge |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 17 ½" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 30" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 20" X 29 ½ " | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 1-5/8" cabinet door magnetic catch white | Home Depot | Model #P110-W | For making an inoculation chamber |
| 2" steel zinc-plated corner brace (8-Pack) | Home Depot | Model #13611 | For making an inoculation box & chamber |
| 3" Corner Clamp | Harbor Freight Tools | SKU 63653, 1852, 60589 | For making inoculation chamber |
| 3/4" steel zinc plated corner brace (4-Pack) | Home Depot | Model #13542 | For making an inoculation box & chamber |
| 4-7/8" zinc-plated light duty door pull handles | Home Depot | Model #15184 | For making an inoculation box |
| Fine fan-blender brushes | Michaels Store | M10472846 | For inoculation |
| Kelleher 3/4" x 3/4" x 36" wood square dowel | Home Depot | NA | For making the lid of an inoculation box |
| Medium density fiberboard (1/4" x 2' x 4'); | Home Depot | Model# 1508104 | For making an inoculation box |
| Round glass coverslips with a 500 µm grid | ibidi USA Inc. | 10816 | For determining spore density |
Referências
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