En enkel og fleksibel inokulasjonsmetode for nøyaktig vurdering av pulverformig mugginfeksjon Fenotyper av Arabidopsis og andre planter
Summary
Vi presenterer en protokoll for å konstruere et enkelt sporedistribusjonssystem bestående av en inokulasjonsboks med et ~ 50 μm nett og et gjennomsiktig plastkammer. Dette kan brukes til jevnt å inokulere planter med pulverformige muggsporer, og dermed muliggjøre nøyaktig og reproduserbar vurdering av sykdomsfenotyper av planter som studeres.
Abstract
Å redusere avlingstap på grunn av soppsykdommer krever forbedret forståelse av mekanismene som styrer planteimmunitet og sopppatogenese, noe som igjen krever nøyaktig bestemmelse av sykdomsfenotyper av planter ved infeksjon med et bestemt sopppatogen. Imidlertid er nøyaktig sykdomsfenotyping med ukulturable biotrofiske sopppatogener som pulverformig mugg ikke lett å oppnå og kan være et hastighetsbegrensende trinn i et forskningsprosjekt. Her har vi utviklet et trygt, effektivt og brukervennlig sykdomsfenotypingssystem ved hjelp av Arabidopsis-pulverformig mugginteraksjon som et eksempel. Dette systemet består hovedsakelig av tre komponenter: (i) en treinokulasjonsboks utstyrt med et avtagbart lokk montert med et rustfritt stål eller nylonnett på ~ 50 μm porer for å inokulere en flat av planter med soppsporer, (ii) et gjennomsiktig plastkammer med en liten frontåpning for å minimere sporeflukt mens du utfører inokulasjon inne, og (iii) en spore-dislodging og distribusjonsmetode for jevn og effektiv inokulasjon. Protokollene som er beskrevet her inkluderer trinnene og parametrene for å lage inokulasjonsboksen og plastkammeret til en lav pris, og en videodemonstrasjon av hvordan du bruker systemet for å muliggjøre jevn inokulering med pulverformige muggsporer, og dermed forbedre nøyaktigheten og reproduserbarheten av sykdomsfenotyping.
Introduction
Pulverformig mugg er en av de vanligste og viktigste sykdommene i mange matavlinger og prydplanter1. Studier av pulverformige muggsykdommer har vært svært populære, noe som fremgår av over 10 500 publikasjoner som søkeresultatet med “pulverformig mugg” som nøkkelord på Web of Science (per november 2020). Faktisk anses pulverformig mugg (representert av Blumeria graminis) å være en av de 10 beste sopppatogenene av tidsskriftet Molecular Plant Pathology2. Kvantifisering av sykdomsfølsomhet er et nødvendig skritt i karakterisering av plantegener som bidrar til sykdomsresistens eller følsomhet, eller funksjonell identifisering av kandidateffektorgener i pulverformig mugg. Imidlertid er pålitelig sykdomsfenotyping langt mer utfordrende med pulverformig mugg sammenlignet med de fleste andre sopppatogener, delvis fordi, i motsetning til sporer av sistnevnte, sporer av pulverformige muggarter (som Golovinomyces cichoracearum UCSC1 basert på vår laboratorieerfaring) viser redusert levedyktighet etter å ha gått gjennom en vannsuspensjonsprosess 3,4 . Utilstrekkelig og/eller ujevn inokulering av testplanter med et bestemt pulverformig muggpatogen kan føre til unøyaktige fenotypingsresultater.
En rekke inokulasjonsmetoder ble rapportert for pulverformige muggstudier. Disse inkluderer (i) børsting av sporer direkte fra infiserte blader for å teste planter5, (ii) sprøyting av en sporesuspensjon for å teste planter6, (iii) blåsing av sporer ved hjelp av et vakuumoperert sedimenteringstårn til planter i bunnen av tårnet7, og (iv) sporelevering ved kombinatorisk bruk av en nylonnettmembran og lydbasert vibrasjon8 . Sporebørstemetoden (eller støvtørking) er enkel å utføre, men ujevn i naturen, og det kan derfor ikke være nøyaktig for kvantitativ vurdering. Spore-sprøyting er praktisk og jevnt, men som nevnt ovenfor kan det føre til dårlig sporespiring4. De to sistnevnte (dvs. iii-iv) er mye forbedrede metoder som er i stand til å oppnå jevn inokulasjon; Begge er imidlertid ikke fleksible når det gjelder å justere inokulasjonskapasiteten når det gjelder antall planter som skal inokuleres i en enkelt hendelse, noe som gjør at begge apparatene ikke er trivielle, og driften er begrenset til laboratorieområder der det er vakuum og / eller strømkilde.
Vårt laboratorium har jobbet med plante-pulverformig mugginteraksjon i over 20 år 9,10. I løpet av det siste tiåret har vi testet en rekke inokulasjonsmetoder og nylig utviklet en enkel og likevel effektiv pulverformingsmetode for mugg. Denne maskebaserte sporebørstemetoden kan sikre jevn inokulasjon, og er enkel og skalerbar, og bør derfor lett tas i bruk av ethvert laboratorium som arbeider med pulverformig mugg.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vår maskeboksbaserte inokulasjonsmetode har flere fordeler i forhold til andre inokulasjonsmetoder. For det første kan den oppnå jevn fordeling av sporer hvis de drives riktig, som vist i figur 5. For det andre kan bruk av ~ 50 μm mesh, pluss spore-dislodging ved mild risting av infiserte blader redusere planteinfeksjon ved thrips eller andre planteinfiserende insekter som er tilstede i kildeplanter. For det tredje kan bruk av inokulasjonsbokser i forskjellige størrelser for inokulasjon…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeidet ble støttet av National Science Foundation (IOS-1901566) til S. Xiao. Forfatterne vil takke F. Coker og C. Hooks for vedlikehold av plantevekstanlegget, og Jorge Zamora for teknisk hjelp knyttet til fabrikasjon av inokulasjonsboksen og kammeret.
Materials
| 48 µm stainless steel grid mesh screen; Size: 24" X 48" | Amazon | NA | For making the lid of an inoculation box |
| #6-32 x ¾" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32 zinc plated nylon lock nut (4-Pack) | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32×3/8” Phillips flat head machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing magnet door catch plates |
| #8-32×1/2" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing corner braces and door hinge |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 17 ½" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 30" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 20" X 29 ½ " | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 1-5/8" cabinet door magnetic catch white | Home Depot | Model #P110-W | For making an inoculation chamber |
| 2" steel zinc-plated corner brace (8-Pack) | Home Depot | Model #13611 | For making an inoculation box & chamber |
| 3" Corner Clamp | Harbor Freight Tools | SKU 63653, 1852, 60589 | For making inoculation chamber |
| 3/4" steel zinc plated corner brace (4-Pack) | Home Depot | Model #13542 | For making an inoculation box & chamber |
| 4-7/8" zinc-plated light duty door pull handles | Home Depot | Model #15184 | For making an inoculation box |
| Fine fan-blender brushes | Michaels Store | M10472846 | For inoculation |
| Kelleher 3/4" x 3/4" x 36" wood square dowel | Home Depot | NA | For making the lid of an inoculation box |
| Medium density fiberboard (1/4" x 2' x 4'); | Home Depot | Model# 1508104 | For making an inoculation box |
| Round glass coverslips with a 500 µm grid | ibidi USA Inc. | 10816 | For determining spore density |
Referências
- Huckelhoven, R., Panstruga, R. Cell bi ology of the plant-powdery mildew interaction. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 738-746 (2011).
- Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Sakurai, H., Hirata, K. Some observations on the relation between the penetration hypha and haustorium of barley powdery mildew and host cell. V. Influence of water spray on the pathogen and host tissue. Annual Phytopathology Society of Japan. 24, 239-245 (1959).
- Shomari, S. H., Kennedy, R. Survival of Oidium anacardii on cashew (Anacardium occidentale) in southern Tanzania. Plant Pathology. 48 (4), 505-513 (1999).
- Sitterly, W. R., Spencer, D. M. . Powdery Mildews. , 369 (1978).
- Reuveni, M., Agapov, V., Reuveni, R. Induction of systemic resistance to powdery mildew and growth increase in cucumber by phosphates. Biological Agriculture & Horticulture. 9 (4), 305-315 (1993).
- Reifschneider, F. J. B., Boiteux, L. S. A vacuum-operated settling tower for inoculation of powdery mildew fungi. Phytopathology. 78 (11), 1463-1465 (1988).
- Chowdhury, A., Bremer, G. B., Salt, D. W., Miller, P., Ford, M. G. A novel method of delivering Blumeria graminis f. sp hordei spores for laboratory experiments. Crop Protection. 22 (7), 917-922 (2003).
- Xiao, S., et al. Broad-spectrum mildew resistance in Arabidopsis thaliana mediated by RPW8. Science. 291 (5501), 118-120 (2001).
- Xiao, S., Ellwood, S., Findlay, K., Oliver, R. P., Turner, J. G. Characterization of three loci controlling resistance of Arabidopsis thaliana accession Ms-0 to two powdery mildew diseases. The Plant Journal. 12 (4), 757-768 (1997).
- Reuber, T. L., et al. Correlation of defense gene induction defects with powdery mildew susceptibility in Arabidopsis enhanced disease susceptibility mutants. The Plant Journal. 16 (4), 473-485 (1998).
- Xiao, S., et al. The atypical resistance gene, RPW8, recruits components of basal defence for powdery mildew resistance in Arabidopsis. The Plant Journal. 42 (1), 95-110 (2005).
