Un método de inoculación fácil y flexible para evaluar con precisión los fenotipos de infección por mildiú polvoriento de Arabidopsis y otras plantas
Summary
Presentamos un protocolo para construir un sistema simple de distribución de esporas que consiste en una caja de inoculación con una malla de ~ 50 μm y una cámara de plástico transparente. Esto se puede utilizar para inocular uniformemente las plantas con esporas de mildiú polvoriento, lo que permite una evaluación precisa y reproducible de los fenotipos de enfermedades de las plantas en estudio.
Abstract
La reducción de las pérdidas de cultivos debido a enfermedades fúngicas requiere una mejor comprensión de los mecanismos que rigen la inmunidad de las plantas y la patogénesis fúngica, lo que a su vez requiere una determinación precisa de los fenotipos de enfermedades de las plantas tras la infección con un patógeno fúngico en particular. Sin embargo, el fenotipado preciso de la enfermedad con patógenos fúngicos biotróficos no cultivables, como el mildiú polvoriento, no es fácil de lograr y puede ser un paso limitante de la velocidad de un proyecto de investigación. Aquí, hemos desarrollado un sistema de fenotipado de enfermedades seguro, eficiente y fácil de operar utilizando la interacción Arabidopsis-mildiú polvoriento como ejemplo. Este sistema consta principalmente de tres componentes: (i) una caja de inoculación de madera equipada con una tapa extraíble montada con una malla de acero inoxidable o nylon de poros de ~ 50 μm para inocular un plano de plantas con esporas de hongos, (ii) una cámara de plástico transparente con una pequeña abertura frontal para minimizar el escape de esporas mientras se realiza la inoculación en el interior, y iii) un método de distribución y desplazamiento de esporas para una inoculación uniforme y eficaz. Los protocolos descritos aquí incluyen los pasos y parámetros para hacer la caja de inoculación y la cámara de plástico a bajo costo, y una demostración en video de cómo usar el sistema para permitir una inoculación uniforme con esporas de mildiú polvoriento, mejorando así la precisión y la reproducibilidad del fenotipado de la enfermedad.
Introduction
El mildiú polvoriento es una de las enfermedades más comunes e importantes de numerosos cultivos alimentarios y plantas ornamentales1. Los estudios de las enfermedades del mildiú polvoriento han sido muy populares, como lo demuestran más de 10,500 publicaciones como resultado de la búsqueda con “mildiú polvoriento” como palabra clave en Web of Science (a partir de noviembre de 2020). De hecho, el mildiú polvoriento (representado por Blumeria graminis) es considerado uno de los 10 principales patógenos fúngicos por la revista Molecular Plant Pathology2. La cuantificación de la susceptibilidad a enfermedades es un paso necesario en la caracterización de los genes de las plantas que contribuyen a la resistencia o susceptibilidad a las enfermedades, o la identificación funcional de genes efectores candidatos en el mildiú polvoriento. Sin embargo, el fenotipado confiable de la enfermedad es mucho más difícil con el mildiú polvoriento en comparación con la mayoría de los otros patógenos fúngicos, en parte porque, a diferencia de las esporas de estos últimos, las esporas de especies de mildiú polvoriento (como Golovinomyces cichoracearum UCSC1 según nuestra experiencia de laboratorio) muestran una viabilidad reducida después de pasar por un proceso de suspensión de agua 3,4 . La inoculación inadecuada y/o desigual de plantas de ensayo con un patógeno particular del mildiú polvoriento puede dar lugar a resultados de fenotipado inexactos.
Se informaron varios métodos de inoculación para estudios de mildiú polvoriento. Estos incluyen (i) cepillado de esporas directamente de las hojas infectadas para probar plantas5, (ii) pulverización de una suspensión de esporas para probar plantas6, (iii) soplado de esporas utilizando una torre de sedimentación operada por vacío a las plantas en la parte inferior de la torre7, y (iv) entrega de esporas mediante el uso combinatorio de una membrana de malla de nylon y vibración basada en el sonido8 . El método de cepillado de esporas (o desempolvado) es fácil de realizar pero de naturaleza desigual, por lo que puede no ser preciso para la evaluación cuantitativa. La pulverización de esporas es conveniente y uniforme, pero como se indicó anteriormente puede resultar en una germinación deficiente de las esporas4. Los dos últimos (es decir, iii-iv) son métodos muy mejorados capaces de lograr una inoculación uniforme; Sin embargo, ambos no son flexibles para ajustar su capacidad de inoculación en términos del número de plantas a inocular en un solo evento, por lo que cualquiera de los aparatos no es trivial, y su operación está restringida a áreas de laboratorio donde hay un vacío y / o fuente de electricidad.
Nuestro laboratorio ha estado trabajando con la interacción planta-mildiú polvoriento durante más de 20 años 9,10. Durante la última década, probamos una serie de métodos de inoculación y recientemente desarrollamos un método de inoculación de mildiú polvoriento simple pero efectivo. Este método de cepillado de esporas basado en malla puede garantizar una inoculación uniforme, y es simple y escalable, por lo que debe ser fácilmente adoptado por cualquier laboratorio que trabaje con mildiú polvoriento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nuestro método de inoculación basado en caja mallada tiene varias ventajas sobre otros métodos de inoculación. En primer lugar, puede lograr una distribución uniforme de las esporas si se opera correctamente, como se demuestra en la Figura 5. En segundo lugar, el uso de malla de ~ 50 μm, más el desplazamiento de esporas mediante el suave movimiento de las hojas infectadas puede reducir la infección de las plantas por trips u otros insectos que infectan las plantas que están presente…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo fue apoyado por la National Science Foundation (IOS-1901566) a S. Xiao. Los autores desean agradecer a F. Coker y C. Hooks por el mantenimiento de la instalación de crecimiento de la planta, y a Jorge Zamora por la ayuda técnica asociada con la fabricación de la caja y la cámara de inoculación.
Materials
| 48 µm stainless steel grid mesh screen; Size: 24" X 48" | Amazon | NA | For making the lid of an inoculation box |
| #6-32 x ¾" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32 zinc plated nylon lock nut (4-Pack) | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32×3/8” Phillips flat head machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing magnet door catch plates |
| #8-32×1/2" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing corner braces and door hinge |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 17 ½" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 30" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 20" X 29 ½ " | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 1-5/8" cabinet door magnetic catch white | Home Depot | Model #P110-W | For making an inoculation chamber |
| 2" steel zinc-plated corner brace (8-Pack) | Home Depot | Model #13611 | For making an inoculation box & chamber |
| 3" Corner Clamp | Harbor Freight Tools | SKU 63653, 1852, 60589 | For making inoculation chamber |
| 3/4" steel zinc plated corner brace (4-Pack) | Home Depot | Model #13542 | For making an inoculation box & chamber |
| 4-7/8" zinc-plated light duty door pull handles | Home Depot | Model #15184 | For making an inoculation box |
| Fine fan-blender brushes | Michaels Store | M10472846 | For inoculation |
| Kelleher 3/4" x 3/4" x 36" wood square dowel | Home Depot | NA | For making the lid of an inoculation box |
| Medium density fiberboard (1/4" x 2' x 4'); | Home Depot | Model# 1508104 | For making an inoculation box |
| Round glass coverslips with a 500 µm grid | ibidi USA Inc. | 10816 | For determining spore density |
Referências
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