En nem og fleksibel podningsmetode til nøjagtig vurdering af melduginfektionsfænotyper af Arabidopsis og andre planter
Summary
Vi præsenterer en protokol til konstruktion af et simpelt sporefordelingssystem bestående af en podningskasse med et ~ 50 μm net og et gennemsigtigt plastkammer. Dette kan bruges til jævnt at inokulere planter med meldugsporer, hvilket muliggør nøjagtig og reproducerbar vurdering af sygdomsfænotyper af planter, der undersøges.
Abstract
Reduktion af afgrødetab på grund af svampesygdomme kræver forbedret forståelse af de mekanismer, der styrer planteimmunitet og svampepatogenese, hvilket igen kræver nøjagtig bestemmelse af sygdomsfænotyper af planter ved infektion med et bestemt svampepatogen. Imidlertid er nøjagtig sygdomsfænotypning med ikke-kultiverbare biotrofiske svampepatogener såsom meldug ikke let at opnå og kan være et hastighedsbegrænsende trin i et forskningsprojekt. Her har vi udviklet et sikkert, effektivt og let at betjene sygdomsfænotypesystem ved hjælp af Arabidopsis-melduginteraktionen som et eksempel. Dette system består hovedsageligt af tre komponenter: (i) en træpodningskasse udstyret med et aftageligt låg monteret med et rustfrit stål- eller nylonnet på ~ 50 μm porer til podning af en flade af planter med svampesporer, (ii) et gennemsigtigt plastkammer med en lille frontåbning for at minimere sporeflugt under podning indeni, og (iii) en spore-løsrivelses- og distributionsmetode til jævn og effektiv podning. De her beskrevne protokoller omfatter trin og parametre til fremstilling af podningsboksen og plastkammeret til en lav pris og en videodemonstration af, hvordan man bruger systemet til at muliggøre jævn podning med meldugsporer og derved forbedre nøjagtigheden og reproducerbarheden af sygdomsfænotypning.
Introduction
Meldug er en af de mest almindelige og vigtige sygdomme i mange fødevareafgrøder og prydplanter1. Undersøgelser af meldugsygdomme har været meget populære, som det fremgår af over 10.500 publikationer som søgeresultat med “meldug” som nøgleord på Web of Science (fra november 2020). Faktisk anses meldug (repræsenteret af Blumeria graminis) for at være en af de 10 bedste svampepatogener af tidsskriftet for molekylær plantepatologi2. Kvantificering af sygdomsmodtagelighed er et nødvendigt skridt i karakterisering af plantegener, der bidrager til sygdomsresistens eller modtagelighed, eller funktionel identifikation af kandidateffektorgener i meldug. Imidlertid er pålidelig sygdomsfænotypning langt mere udfordrende med meldug sammenlignet med de fleste andre svampepatogener, dels fordi sporer af meldugarter (såsom Golovinomyces cichoracearum UCSC1 baseret på vores laboratorieerfaring) i modsætning til sporer af sidstnævnte viser reduceret levedygtighed efter at have gennemgået en vandsuspensionsproces 3,4 . Utilstrækkelig og/eller ujævn podning af testplanter med et bestemt meldugpatogen kan føre til unøjagtige fænotyperesultater.
Der blev rapporteret om en række podningsmetoder til undersøgelser af meldug. Disse omfatter i) børstning af sporer direkte fra inficerede blade til testanlæg5, ii) sprøjtning af en sporeophæng til testanlæg6, iii) blæsning af sporer ved hjælp af et vakuumdrevet bundfældningstårn til planter i bunden af tårnet7 og iv) sporelevering ved kombinatorisk brug af en nylonnetmembran og lydbaserede vibrationer8 . Sporebørstningsmetoden (eller støvningen) er let at udføre, men ujævn i naturen, og den er derfor muligvis ikke nøjagtig til kvantitativ vurdering. Sporesprøjtning er praktisk og jævn, men som nævnt ovenfor kan det resultere i dårlig sporespiring4. De to sidstnævnte (dvs. iii-iv) er meget forbedrede metoder, der er i stand til at opnå jævn podning; Begge er imidlertid ikke fleksible med hensyn til at justere deres podningskapacitet med hensyn til antallet af anlæg, der skal podes i en enkelt begivenhed, hvilket gør begge apparater ikke trivielle, og deres drift er begrænset til laboratorieområder, hvor der er et vakuum og / eller elektricitetskilde.
Vores laboratorium har arbejdet med plantepulver meldug interaktion i over 20 år 9,10. I løbet af det sidste årti testede vi en række podningsmetoder og udviklede for nylig en enkel og alligevel effektiv pulverlakoneringsmetode. Denne mesh-baserede sporebørstningsmetode kan sikre jævn podning og er enkel og skalerbar, og bør derfor let vedtages af ethvert laboratorium, der arbejder med meldug.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vores meshed-box-baserede podningsmetode har flere fordele i forhold til andre podningsmetoder. For det første kan det opnå en jævn fordeling af sporer, hvis det betjenes korrekt, som vist i figur 5. For det andet kan brugen af ~ 50 μm mesh plus spore-løsrivelse ved blid omrystning af inficerede blade reducere planteinfektion ved thrips eller andre planteinficerende insekter, der er til stede i kildeplanter. For det tredje kan brugen af inokuleringsbokse i forskellige størrelser til po…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejdet blev støttet af National Science Foundation (IOS-1901566) til S. Xiao. Forfatterne vil gerne takke F. Coker og C. Hooks for vedligeholdelsen af plantevækstanlægget og Jorge Zamora for teknisk hjælp i forbindelse med fremstilling af podningskassen og kammeret.
Materials
| 48 µm stainless steel grid mesh screen; Size: 24" X 48" | Amazon | NA | For making the lid of an inoculation box |
| #6-32 x ¾" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32 zinc plated nylon lock nut (4-Pack) | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32×3/8” Phillips flat head machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing magnet door catch plates |
| #8-32×1/2" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing corner braces and door hinge |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 17 ½" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 30" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 20" X 29 ½ " | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 1-5/8" cabinet door magnetic catch white | Home Depot | Model #P110-W | For making an inoculation chamber |
| 2" steel zinc-plated corner brace (8-Pack) | Home Depot | Model #13611 | For making an inoculation box & chamber |
| 3" Corner Clamp | Harbor Freight Tools | SKU 63653, 1852, 60589 | For making inoculation chamber |
| 3/4" steel zinc plated corner brace (4-Pack) | Home Depot | Model #13542 | For making an inoculation box & chamber |
| 4-7/8" zinc-plated light duty door pull handles | Home Depot | Model #15184 | For making an inoculation box |
| Fine fan-blender brushes | Michaels Store | M10472846 | For inoculation |
| Kelleher 3/4" x 3/4" x 36" wood square dowel | Home Depot | NA | For making the lid of an inoculation box |
| Medium density fiberboard (1/4" x 2' x 4'); | Home Depot | Model# 1508104 | For making an inoculation box |
| Round glass coverslips with a 500 µm grid | ibidi USA Inc. | 10816 | For determining spore density |
Referências
- Huckelhoven, R., Panstruga, R. Cell bi ology of the plant-powdery mildew interaction. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 738-746 (2011).
- Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Sakurai, H., Hirata, K. Some observations on the relation between the penetration hypha and haustorium of barley powdery mildew and host cell. V. Influence of water spray on the pathogen and host tissue. Annual Phytopathology Society of Japan. 24, 239-245 (1959).
- Shomari, S. H., Kennedy, R. Survival of Oidium anacardii on cashew (Anacardium occidentale) in southern Tanzania. Plant Pathology. 48 (4), 505-513 (1999).
- Sitterly, W. R., Spencer, D. M. . Powdery Mildews. , 369 (1978).
- Reuveni, M., Agapov, V., Reuveni, R. Induction of systemic resistance to powdery mildew and growth increase in cucumber by phosphates. Biological Agriculture & Horticulture. 9 (4), 305-315 (1993).
- Reifschneider, F. J. B., Boiteux, L. S. A vacuum-operated settling tower for inoculation of powdery mildew fungi. Phytopathology. 78 (11), 1463-1465 (1988).
- Chowdhury, A., Bremer, G. B., Salt, D. W., Miller, P., Ford, M. G. A novel method of delivering Blumeria graminis f. sp hordei spores for laboratory experiments. Crop Protection. 22 (7), 917-922 (2003).
- Xiao, S., et al. Broad-spectrum mildew resistance in Arabidopsis thaliana mediated by RPW8. Science. 291 (5501), 118-120 (2001).
- Xiao, S., Ellwood, S., Findlay, K., Oliver, R. P., Turner, J. G. Characterization of three loci controlling resistance of Arabidopsis thaliana accession Ms-0 to two powdery mildew diseases. The Plant Journal. 12 (4), 757-768 (1997).
- Reuber, T. L., et al. Correlation of defense gene induction defects with powdery mildew susceptibility in Arabidopsis enhanced disease susceptibility mutants. The Plant Journal. 16 (4), 473-485 (1998).
- Xiao, S., et al. The atypical resistance gene, RPW8, recruits components of basal defence for powdery mildew resistance in Arabidopsis. The Plant Journal. 42 (1), 95-110 (2005).
