عزل خلايا كبد الفئران الأولية مع التحكم في التروية متعدد المعلمات
Summary
يفصل هذا البروتوكول استخدام قسطرة وريدية خاصة ، وأنابيب معقمة موحدة يمكن التخلص منها ، والتحكم في درجة الحرارة تكملها مراقبة في الوقت الفعلي ، ونظام إنذار لإجراء تروية الكولاجيناز المكون من خطوتين لتحسين الاتساق في صلاحية خلايا كبد الفئران الأولية المعزولة وإنتاجيتها ووظائفها.
Abstract
تستخدم خلايا الكبد الأولية على نطاق واسع في البحوث الأساسية حول أمراض الكبد واختبار السمية في المختبر. يعد إجراء تروية الكولاجيناز المكون من خطوتين لعزل خلايا الكبد الأولية تحديا تقنيا ، خاصة في تعليب الوريد البابي. الإجراء عرضة أيضا للتلوث العرضي والاختلافات في ظروف التروية بسبب الصعوبات في تجميع أو تحسين أو صيانة إعداد التروية. هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل لإجراء محسنة من خطوتين لتروية الكولاجيناز مع التحكم في التروية متعدد المعلمات. تم عزل خلايا كبد الفئران الأولية بنجاح وموثوقية من خلال اتخاذ الاحتياطات التقنية اللازمة في الخطوات الحرجة للإجراء ، وعن طريق الحد من الصعوبة التشغيلية والتخفيف من تباين معلمات التروية من خلال اعتماد قسطرة وريدية خاصة ، وأنابيب معقمة موحدة يمكن التخلص منها ، والتحكم في درجة الحرارة ، ونظام المراقبة والإنذار في الوقت الفعلي. تظهر خلايا كبد الفئران الأولية المعزولة باستمرار قابلية عالية للخلايا (85٪ -95٪) ، والعائد (2-5 × 108 خلايا لكل 200-300 غرام من الفئران) والوظائف (الألبومين واليوريا ونشاط CYP). وقد استكمل هذا الإجراء بنظام متكامل لتروية الدم، وهو مدمج بما يكفي ليتم إعداده في غطاء التدفق الرقائقي لضمان التشغيل المعقم.
Introduction
خلايا الكبد الأولية هي أدوات مهمة للبحوث الأساسية المتعلقة بالكبد ، وعلاج الأمراض ، والتطبيق مثل اختبار المخدرات. المعيار الذهبي الحالي لعزل خلايا الكبد الأولية هو إجراء تروية الكولاجيناز المكون من خطوتين 1،2،3 الذي قدمه Seglen في 1970s4. ومع ذلك ، فإن هذا الإجراء يمثل تحديا تقنيا ولديه معدل فشل مرتفع عند إجرائه من قبل الجراحين المبتدئين. حتى عندما يعتبر التروية ناجحا ، يمكن ملاحظة اختلافات جذرية في صلاحية خلايا الكبد (عادة 60٪ -95٪) والعائد (0.5-5 × 108 لكل 200-300 غرام من الفئران) بين العزلات. وهذا يؤثر على جودة وحجم التجارب النهائية. بصرف النظر عن الإجراء الفني ، فإن إعداد التروية المستخدم في العزل ، سواء كان متاحا تجاريا أو مخصصا ، هو عامل مساهم. يجب إيلاء الاهتمام لتجميع وتحسين وصيانة إعداد التروية. الغرض من هذا البروتوكول هو تحسين معدل النجاح والاستقرار بين عزل خلايا كبد الفئران الأولية من خلال التحكم في التروية متعددة المعلمات للإجراء الفني وإعداد التروية لإجراء تروية الكولاجيناز المكون من خطوتين.
من الجانب التقني ، فإن الخطوة الأكثر صعوبة في الإجراء هي تعليب الوريد البابي. أما بالنسبة للخطوات الأخرى ، إذا لوحظت الممارسة الجيدة وتم اتخاذ الاحتياطات العامة ، يمكن تحسين استقرار العزل. لذلك ، فإن فهم المنطق لكل خطوة مهم حتى يتمكن الجراح من الاستجابة للمتغيرات المختلفة التي قد تحدث أثناء الإجراء.
تم نشر بروتوكولات مختلفة لعزل خلايا الكبد وخلايا الكبد غير المتنية من الفئران والفئران1،2،5،6،7،8،9. كان لإعدادات التروية المستخدمة في هذه البروتوكولات العديد من العيوب ، والتي تشمل إعادة استخدام أنابيب التروية ، ومشاكل في التحكم في درجة الحرارة ، والحاجة إلى التحسين الروتيني لمعلمات التروية ، و / أو استخدام نوع غير مناسب من القسطرة الوريدية (IV) لقنية الوريد البابي. ستزيد إعادة استخدام أنابيب التروية من فرص التلوث ، خاصة إذا لم يتم تنظيف الأنابيب وتطهيرها بشكل صحيح. كما أن إعادة استخدام الأنابيب دون استبدال روتيني سيعرض إعداد التروية لمشاكل مثل الأنابيب أو الموصلات المتسربة ، ومصيدة الفقاعات المسدودة والأنابيب الضيقة ، وكلها ستقلل بشكل كبير من ضغط البيرفوسات ومعدل التدفق ، وبالتالي ، مما يؤثر على كفاءة هضم الكبد. بدون مصدر حرارة ثابت في بعض الإعدادات للتحكم في درجة الحرارة ، سوف تبرد المخازن المؤقتة التي تم تسخينها مسبقا بمرور الوقت ، مما يؤدي إلى انخفاض نشاط الكولاجيناز والهضم. على الرغم من أن الإعدادات الأخرى تستخدم مكثفا زجاجيا مغلفا متصلا بجهاز تدوير المياه لتدفئة المخزن المؤقت ، إلا أنها ضخمة وتتطلب تنظيفا دقيقا. يجب قياس درجة الحرارة والضغط ومعدل تدفق المخزن المؤقت الخارج من القسطرة وتحسينه قبل بدء العزل لضمان حالة تروية مستقرة. حتى بعد التحسين ، لا يزال من الممكن أن تتغير المعلمات في منتصف الطريق أثناء العزل بسبب تصرفات المشغل ، مما يؤدي إلى التروية والهضم دون المستوى الأمثل. معظم أنواع القسطرة الوريدية ليست مناسبة لتعليب الوريد البابي لأنها لا تسمح بالتروية المستمرة أثناء التعليب. إنهم غير قادرين على إبلاغ الجراح على الفور عند نجاح القنية. علاوة على ذلك ، من الصعب تأمين الوريد البابي على القسطرة الناعمة دون تشويهها.
هنا ، نعالج هذه المشكلات باستخدام أنابيب معقمة موحدة يمكن التخلص منها ، وسترة سخان سيليكون للتحكم الدقيق والمستقر في درجة الحرارة ، ونظام المراقبة والإنذار في الوقت الفعلي مع تخزين البيانات وإدارتها واستخدام قسطرة IV خاصة ، والتي تسمح بالتروية المستمرة أثناء ثقب الوريد البابي أثناء التعليب. على حد علمنا ، نحن أول مجموعة تجمع بين كل هذه الميزات في نظام تروية متكامل (IPS) صغير الحجم ، مما يجعله محمولا للغاية وقادرا على وضعه في غطاء تدفق صفحي لضمان التشغيل المعقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك بعض النقاط التي من المهم بشكل خاص ملاحظتها لإجراء تروية الكولاجيناز المكون من خطوتين بشكل عام. أولا ، يجب إيلاء عناية خاصة عند استئصال الكبد. تأكد من عدم تلف الجهاز الهضمي لأن تسرب المحتويات سيؤدي إلى تلوث بكتيري. بالإضافة إلى ذلك ، تجنب إتلاف كبسولة غليسون ، التي تغطي سطح الكبد أثناء …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم هذا العمل جزئيا من قبل وزارة التربية والتعليم ARC (MOE2017-T2-1-149) ؛ منحة بذور الابتكار في NUHS 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02) ؛ معهد علم الأحياء الميكانيكي في سنغافورة (R-714-106-004-135); ومعهد الهندسة الحيوية وتكنولوجيا النانو، مجلس البحوث الطبية الحيوية، وكالة العلوم والتكنولوجيا والبحوث (A*STAR) (أرقام المشاريع IAF-PP H18/01/a0/014، IAF-PP H18/01/a0/K14 و MedCaP-LOA-18-02) تمويل إلى هانري يو. نغ تشان واي هو باحث باحث في جامعة سنغافورة الوطنية. نود أن نشكر وحدة المجهر البؤري ووحدة قياس التدفق الخلوي بجامعة سنغافورة الوطنية على المساعدة والمشورة في تحليل نقاء خلايا الكبد.
Materials
| Material/Equipment | |||
| 1 mL syringe | Nipro | ||
| 27G needle | Nipro | ||
| Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture | Look | SP117 | |
| Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip | Bochem | 10333511 | |
| Disposable Perfusion Set | Vasinfuse | BPF-112 | |
| Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Sigma-Aldrich | R3133 | |
| German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1×2 teeth , 14.5cm | Walentech | ||
| Greiner Cellstar aspirating pipette | Merck | GN710183 | |
| Haemocytometer | |||
| Integrated Perfusion System | Vasinfuse | IPS-001 | |
| Iris Scissors curved, stainless, 11cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | CVD | |
| Light microscope with 10X lens | Olympus | ||
| Mesh Sheet 100µM Nylon | Spectra-Teknic(s) Pte Ltd | 06630-75 | |
| Operating Scissors, BL/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – BL/BL | |
| Operating Scissors, SH/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – SH/BL | |
| Reverse force hemostatic clip | Shanghai Jin Zhong Pte Ltd | XEC230 | |
| Water bath | Grant | ||
| Reagents/Chemicals | |||
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9056 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 137101 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | |
| Dexamethasone | TCI | D1961 | |
| DMEM | Gibco | 31600-034 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Invitrogen | 11344-041 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 1-9278 | |
| KCl | VWR | VWRC26764.298 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Linoleic acid | Sigma-Aldrich | L9530 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Type I bovine collagen | Advanced BioMatrix | 5005-100ml | |
| William’s E Media | Sigma-Aldrich | W1878 |
Referências
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Green, C. J., et al. The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus. Cell and Tissue Banking. 18 (4), 597-604 (2017).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3138 (2011).
- Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. Isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3669 (2012).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60501 (2019).
- Shi, W., et al. Isolation and purification of immune cells from the liver. International Immunopharmacology. 85 (95), 106632 (2020).
- Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive L-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).
- Xia, L., et al. Tethered spheroids as an in vitro hepatocyte model for drug safety screening. Biomaterials. 33 (7), 2165-2176 (2012).
- Kegel, V., et al. Protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53069 (2016).
- Zhu, L., et al. A vertical-flow bioreactor array compacts hepatocytes for enhanced polarity and functions. Lab on a Chip. 16 (20), 3898-3908 (2016).
- Du, Y., et al. Synthetic sandwich culture of 3D hepatocyte monolayer. Biomaterials. 29 (3), 290-301 (2008).
- Tong, W. H., et al. Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture. Biomaterials. 80, 106-120 (2016).
- Xia, L., et al. Laminar-flow immediate-overlay hepatocyte sandwich perfusion system for drug hepatotoxicity testing. Biomaterials. 30 (30), 5927-5936 (2009).
- Gupta, K., et al. Bile canaliculi contract autonomously by releasing calcium into hepatocytes via mechanosensitive calcium channel. Biomaterials. 259, 120283 (2020).
- Horner, R., et al. Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).
- Osypiw, J. C., et al. Subpopulations of rat hepatocytes separated by Percoll density-gradient centrifugation show characteristics consistent with different acinar locations. The Biochemical Journal. 304, 617-624 (1994).
- Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).
- Hillebrandt, K., et al. Procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), e53029 (2015).
