Isolatie van primaire rattenhepatocyten met multiparameterperfusiecontrole
Summary
Dit protocol beschrijft het gebruik van een speciale intraveneuze katheter, gestandaardiseerde steriele wegwerpslangen, temperatuurregeling aangevuld met real-time monitoring en een alarmsysteem voor tweestaps collagenaseperfusieprocedure om de consistentie in de levensvatbaarheid, opbrengst en functionaliteit van geïsoleerde primaire rathepatocyten te verbeteren.
Abstract
Primaire hepatocyten worden veel gebruikt in fundamenteel onderzoek naar leverziekten en voor toxiciteitstests in vitro. De tweestaps collagenaseperfusieprocedure voor primaire hepatocytenisolatie is technisch uitdagend, vooral bij portale adercannulatie. De procedure is ook gevoelig voor incidentele verontreiniging en variaties in perfusieomstandigheden als gevolg van problemen bij de assemblage, optimalisatie of onderhoud van de perfusie-opstelling. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor een verbeterde tweestaps collagenaseperfusieprocedure met multiparameterperfusiecontrole. Primaire rattenhepatocyten werden met succes en betrouwbaar geïsoleerd door de nodige technische voorzorgsmaatregelen te nemen bij kritieke stappen van de procedure, en door de operationele moeilijkheid te verminderen en de variabiliteit van perfusieparameters te verminderen door de toepassing van een speciale intraveneuze katheter, gestandaardiseerde steriele wegwerpslang, temperatuurregeling en real-time monitoring- en alarmsysteem. De geïsoleerde primaire rattenhepatocyten vertonen consequent een hoge cel levensvatbaarheid (85%-95%), opbrengst (2-5 x 108 cellen per 200-300 g rat) en functionaliteit (albumine, ureum en CYP-activiteit). De procedure werd aangevuld met een geïntegreerd perfusiesysteem, dat compact genoeg is om in de laminaire stromingskap te worden geïnstalleerd om een aseptische werking te garanderen.
Introduction
Primaire hepatocyten zijn belangrijke hulpmiddelen voor levergerelateerd fundamenteel onderzoek, ziektebehandeling en toepassing zoals het testen van geneesmiddelen. De huidige gouden standaard voor primaire hepatocytenisolatie is de tweestaps collagenaseperfusieprocedure 1,2,3 geïntroduceerd door Seglen in de jaren 19704. Deze procedure is echter technisch uitdagend en heeft een hoog faalpercentage wanneer uitgevoerd door beginnende chirurgen. Zelfs wanneer een perfusie als succesvol wordt beschouwd, kunnen drastische verschillen in levensvatbaarheid van hepatocyten (typisch 60% -95%) en opbrengst (0,5-5 x 108 per 200-300 g rat) worden waargenomen tussen isolaties. Dit beïnvloedt de kwaliteit en schaal van downstream experimenten. Afgezien van de technische procedure, is de perfusie-opstelling die wordt gebruikt voor de isolatie, commercieel verkrijgbaar of op maat gemaakt, een bijdragende factor. Er moet aandacht worden besteed aan de montage, optimalisatie en het onderhoud van de perfusie-opstelling. Het doel van dit protocol is om het succespercentage en de stabiliteit tussen isolaties van primaire rathepatocyten te verbeteren door middel van multiparameter perfusiecontrole van de technische procedure en perfusie-instelling van de tweestaps collagenaseperfusieprocedure.
Vanuit het technische aspect is de moeilijkste stap in de procedure de portaaladercannulatie. Wat de andere stappen betreft, als goede praktijken in acht worden genomen en algemene voorzorgsmaatregelen worden genomen, kan de stabiliteit van de isolatie worden verbeterd. Daarom is het belangrijk om de redenering voor elke stap te begrijpen, zodat de chirurg kan reageren op verschillende variabelen die tijdens de procedure kunnen optreden.
Verschillende protocollen voor de isolatie van hepatocyten en lever niet-parenchymale cellen van rat en muis zijn gepubliceerd 1,2,5,6,7,8,9. De perfusie-opstellingen die in deze protocollen worden gebruikt, hadden verschillende nadelen, waaronder het hergebruik van perfusiebuizen, problemen met temperatuurregeling, behoefte aan routinematige optimalisatie van perfusieparameters en / of gebruik van ongeschikt type intraveneuze (IV) katheter voor portale aderconnulatie. Het hergebruik van perfusiebuizen vergroot de kans op besmetting, zeker als de slang niet goed gereinigd en gedesinfecteerd is. Hergebruik van buizen zonder routinematige vervanging zal de perfusie-opstelling ook blootstellen aan problemen zoals lekkende buizen of connectoren, verstopte bellenvanger en vernauwde slangen, die allemaal de perfusaatdruk en stroomsnelheid aanzienlijk zullen verminderen, waardoor de efficiëntie van de leververtering wordt beïnvloed. Zonder een constante warmtebron in sommige opstellingen voor temperatuurregeling, zullen voorverwarmde buffers na verloop van tijd afkoelen, wat leidt tot een lage collagenase-activiteit en spijsvertering. Hoewel andere opstellingen een glazen condensor met mantel gebruiken die is aangesloten op een watercirculatiepomp om de buffer te verwarmen, zijn ze omvangrijk en moeten ze zorgvuldig worden gereinigd. Temperatuur, druk en debiet van de buffer die de katheter verlaat, moeten vóór het begin van de isolatie worden gemeten en geoptimaliseerd om een stabiele perfusieconditie te verzekeren. Zelfs na optimalisatie kunnen de parameters nog steeds halverwege de isolatie veranderen als gevolg van de acties van de operator, wat leidt tot suboptimale perfusie en spijsvertering. De meeste soorten IV-katheters zijn niet geschikt voor poortader cannulatie omdat ze geen continue perfusie tijdens cannulatie toestaan. Ze zijn niet in staat om de chirurg onmiddellijk te informeren wanneer de cannulatie succesvol is. Bovendien is het een uitdaging om de poortader op de zachte katheter vast te zetten zonder deze te vervormen.
Hier pakken we deze problemen aan met behulp van gestandaardiseerde steriele wegwerpbuizen, een siliconen verwarmingsmantel voor nauwkeurige en stabiele temperatuurregeling, real-time bewaking en alarmsysteem met gegevensopslag en -beheer en gebruik van een speciale IV-katheter, die continue perfusie mogelijk maakt tijdens het doorboren van de poortader tijdens cannulatie. Voor zover we weten, zijn we de eerste groep die al deze functies combineert in een geïntegreerd perfusiesysteem (IPS) dat compact is, waardoor het zeer draagbaar is en in een laminaire stroomkap kan worden geplaatst om een aseptische werking te garanderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn een paar punten die bijzonder belangrijk zijn om in acht te nemen voor de tweestaps collagenaseperfusieprocedure in het algemeen. Ten eerste moet speciale zorg worden besteed bij het reseceren van de lever. Zorg ervoor dat het maagdarmkanaal niet wordt beschadigd, omdat lekkage van de inhoud zal leiden tot bacteriële besmetting. Vermijd bovendien beschadiging van de Glisson-capsule, die het oppervlak van de lever bedekt tijdens de dierprocedure. Als de scheur groot genoeg is, kan dit voortijdige afgifte van gedi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door MOE ARC (MOE2017-T2-1-149); NUHS Innovation Seed Grant 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02); Mechanobiology Institute of Singapore (R-714-106-004-135); en Institute of Bioengineering and Nanotechnology, Biomedical Research Council, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR) (Project Numbers IAF-PP H18/01/a0/014, IAF-PP H18/01/a0/K14 en MedCaP-LOA-18-02) financiering aan Hanry Yu. Ng Chan Way is een onderzoeker van de National University of Singapore. We willen graag confocale microscopie-eenheid en flowcytometrie-eenheid van de National University of Singapore bedanken voor hulp en advies bij de zuiverheidsanalyse van hepatocyten.
Materials
| Material/Equipment | |||
| 1 mL syringe | Nipro | ||
| 27G needle | Nipro | ||
| Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture | Look | SP117 | |
| Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip | Bochem | 10333511 | |
| Disposable Perfusion Set | Vasinfuse | BPF-112 | |
| Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Sigma-Aldrich | R3133 | |
| German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1×2 teeth , 14.5cm | Walentech | ||
| Greiner Cellstar aspirating pipette | Merck | GN710183 | |
| Haemocytometer | |||
| Integrated Perfusion System | Vasinfuse | IPS-001 | |
| Iris Scissors curved, stainless, 11cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | CVD | |
| Light microscope with 10X lens | Olympus | ||
| Mesh Sheet 100µM Nylon | Spectra-Teknic(s) Pte Ltd | 06630-75 | |
| Operating Scissors, BL/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – BL/BL | |
| Operating Scissors, SH/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – SH/BL | |
| Reverse force hemostatic clip | Shanghai Jin Zhong Pte Ltd | XEC230 | |
| Water bath | Grant | ||
| Reagents/Chemicals | |||
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9056 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 137101 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | |
| Dexamethasone | TCI | D1961 | |
| DMEM | Gibco | 31600-034 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Invitrogen | 11344-041 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 1-9278 | |
| KCl | VWR | VWRC26764.298 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Linoleic acid | Sigma-Aldrich | L9530 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Type I bovine collagen | Advanced BioMatrix | 5005-100ml | |
| William’s E Media | Sigma-Aldrich | W1878 |
Referências
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. H., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Green, C. J., et al. The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus. Cell and Tissue Banking. 18 (4), 597-604 (2017).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3138 (2011).
- Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. Isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3669 (2012).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60501 (2019).
- Shi, W., et al. Isolation and purification of immune cells from the liver. International Immunopharmacology. 85 (95), 106632 (2020).
- Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive L-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).
- Xia, L., et al. Tethered spheroids as an in vitro hepatocyte model for drug safety screening. Biomaterials. 33 (7), 2165-2176 (2012).
- Kegel, V., et al. Protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53069 (2016).
- Zhu, L., et al. A vertical-flow bioreactor array compacts hepatocytes for enhanced polarity and functions. Lab on a Chip. 16 (20), 3898-3908 (2016).
- Du, Y., et al. Synthetic sandwich culture of 3D hepatocyte monolayer. Biomaterials. 29 (3), 290-301 (2008).
- Tong, W. H., et al. Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture. Biomaterials. 80, 106-120 (2016).
- Xia, L., et al. Laminar-flow immediate-overlay hepatocyte sandwich perfusion system for drug hepatotoxicity testing. Biomaterials. 30 (30), 5927-5936 (2009).
- Gupta, K., et al. Bile canaliculi contract autonomously by releasing calcium into hepatocytes via mechanosensitive calcium channel. Biomaterials. 259, 120283 (2020).
- Horner, R., et al. Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).
- Osypiw, J. C., et al. Subpopulations of rat hepatocytes separated by Percoll density-gradient centrifugation show characteristics consistent with different acinar locations. The Biochemical Journal. 304, 617-624 (1994).
- Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).
- Hillebrandt, K., et al. Procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), e53029 (2015).
