यहां, परिणामस्वरूप डेटा का विश्लेषण करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लाइटशीट माइक्रोस्कोप और एक छवि प्रसंस्करण वर्कस्टेशन का उपयोग करके ओकुलर मॉर्फोजेनेसिस के समय-अंतराल इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। यह प्रोटोकॉल भ्रूण संज्ञाहरण के लिए प्रक्रियाओं का विवरण देता है, कम पिघलने वाले तापमान में एम्बेडिंग, इमेजिंग चैंबर में निलंबन, इमेजिंग पैरामीटर स्थापित करता है, और अंत में छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके इमेजिंग डेटा का विश्लेषण करता है।
कशेरुकी आंखों का विकास एक जटिल प्रक्रिया है जो भ्रूण गैस्ट्रुलेशन के अंत के पास शुरू होती है और सेल माइग्रेशन, प्रसार और भेदभाव के सटीक समन्वय की आवश्यकता होती है। टाइम-लैप्स कल्पना आंखों के विकास के दौरान कोशिकाओं के व्यवहार के लिए अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान करती है क्योंकि यह हमें विवो में ओकुलोजेनेसिस की कल्पना करने की अनुमति देती है। ज़ेबराफ़िश इस प्रक्रिया को उनकी अत्यधिक संरक्षित कशेरुकी आंखों और ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी रहते हुए तेजी से और बाहरी रूप से विकसित करने की उनकी क्षमता के कारण इस प्रक्रिया की कल्पना करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है। ज़ेब्राफ़िश आंखों के विकास के समय-अंतराल इमेजिंग अध्ययनों को ट्रांसजेनिक ज़ेब्राफ़िश लाइन टीजी (आरएक्स 3: जीएफपी) के उपयोग से बहुत सुविधाजनक बनाया जाता है। विकासशील फोरब्रेन में, आरएक्स 3: जीएफपी अभिव्यक्ति एकल आंख क्षेत्र की कोशिकाओं को चिह्नित करती है, और जीएफपी को व्यक्त किया जाना जारी है क्योंकि आंख क्षेत्र एक ऑप्टिक पुटिका बनाने के लिए evaginates, जो तब एक ऑप्टिक कप बनाने के लिए invaginates। Rx3: GFP अभिव्यक्ति के उच्च रिज़ॉल्यूशन समय अंतराल इमेजिंग, इसलिए, हमें समय के माध्यम से आंखों के प्राइमोर्डियम को ट्रैक करने की अनुमति देता है क्योंकि यह रेटिना में विकसित होता है। Lightsheet माइक्रोस्कोपी फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए मोटे नमूनों में प्रवेश करने की अपनी क्षमता के कारण समय के साथ ओकुलर मॉर्फोजेनेसिस की छवि बनाने के लिए एक आदर्श तरीका है, फोटोब्लीचिंग और फोटोटॉक्सिसिटी को कम करता है, और उच्च गति पर छवि। यहां, परिणामस्वरूप डेटा का विश्लेषण करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लाइटशीट माइक्रोस्कोप और एक छवि प्रसंस्करण वर्कस्टेशन का उपयोग करके ओकुलर मॉर्फोजेनेसिस के समय-अंतराल इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। यह प्रोटोकॉल भ्रूण संज्ञाहरण के लिए प्रक्रियाओं का विवरण देता है, कम पिघलने वाले तापमान में एम्बेडिंग, इमेजिंग चैंबर में निलंबन, इमेजिंग पैरामीटर स्थापित करता है, और अंत में छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके इमेजिंग डेटा का विश्लेषण करता है। परिणामी डेटासेट ओकुलर मॉर्फोजेनेसिस की प्रक्रिया में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है, साथ ही आनुवंशिक उत्परिवर्तन, औषधीय एजेंटों के संपर्क, या अन्य प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के परिणामस्वरूप इस प्रक्रिया के लिए परेशान करता है।
भ्रूण विकास एक जटिल प्रक्रिया है जिसके लिए कई अलग-अलग घटनाओं के सटीक समन्वय की आवश्यकता होती है। कशेरुकी आंख का गठन विकासशील अग्रमस्तिष्क में शुरू होता है, जहां कोशिकाओं का एक हिस्सा आंख क्षेत्र के रूप में निर्दिष्ट होता है। ये कोशिकाएं सतह एक्टोडर्म की ओर बढ़ेंगी, जिससे दो द्विपक्षीय ऑप्टिक पुटिकाओंको जन्म मिलेगा 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10। सतह एक्टोडर्म के साथ संपर्क तब ऑप्टिक पुटिका के एक ऑप्टिक कप में एक invagination प्रेरित करता है। सतह एक्टोडर्म आंख की पूर्वकाल संरचनाओं को जन्म देगा, जैसे कि लेंस और कॉर्निया, जबकि ऑप्टिक कप तंत्रिका रेटिना और रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम को जन्म देगा 1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,12 . इस प्रक्रिया में व्यवधान जन्मजात दोषों जैसे माइक्रोफ्थैलमिया, एनोफ्थैलमिया और कोलोबोमा (मैक) को जन्म दे सकता है। इस समय, इन दोषों को ठीक करने के लिए कोई विकल्प नहीं है 3,5,6,7,9,10,11,12. ओकुलर मॉर्फोजेनेसिस के तंत्र के आगे के अध्ययन और मैक को जन्म देने वाली समस्याएं ज्ञान की एक नींव प्रदान करेंगी जो संभावित रूप से उपचार का कारण बनेंगी। आंखों के विकास के दौरान कोशिकाओं के गतिशील व्यवहार की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण समय-अंतराल कल्पना है, जो इस प्रक्रिया को विवो में और वास्तविक समय में कल्पना और विशेषता की अनुमति देता है।
Zebrafish (Danio rerio) समय-अंतराल इमेजिंग का उपयोग करके शुरुआती ओकुलर विकास की कल्पना करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है। उनके पास एक अत्यधिक संरक्षित कशेरुकी आंख है और ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी रहते हुए तेजी से और बाहरी रूप से विकसित करने की क्षमता रखतेहैं। ज़ेब्राफ़िश इन विशेषताओं के कारण समय-अंतराल इमेजिंग के लिए एक महान संसाधन प्रदान करता है जो स्तनधारी मॉडल की कमी है। ज़ेब्राफ़िश आंखों के विकास के समय-अंतराल इमेजिंग अध्ययन को ट्रांसजेनिक ज़ेब्राफ़िश लाइन टीजी (आरएक्स 3: जीएफपी) 13 के उपयोग से बहुत सुविधाजनक बनाया जाता है। Rx3 (रेटिना होमोबॉक्स प्रोटीन 3) आंखों के विकास के लिए आवश्यक एक प्रतिलेखन कारकहै। Rx3 ज़ेब्राफ़िश में तीन आरएक्स जीनों में से पहला है, जिसे व्यक्त किया जाना है, इसकी अभिव्यक्ति को मध्य-गैस्ट्रुलेशन शुरू किया गया है, लगभग 8 एच पोस्ट निषेचन (एचपीएफ) 15,16। Rx3: GFP ट्रांसजीन को 1 सोमाइट चरण (एसएस), लगभग 10 hpf15,17,18,19,20 पर शुरू होने वाले विकासशील अग्रमस्तिष्क में कल्पना की जा सकती है। विकासशील अग्रमस्तिष्क में, आरएक्स 3: जीएफपी अभिव्यक्ति एकल आंख क्षेत्र की कोशिकाओं को चिह्नित करती है, और जीएफपी (हरे रंग के फ्लोरोसेंट प्रोटीन) को ओकुलर मॉर्फोजेनेसिस के शेष के माध्यम से व्यक्त किया जाना जारी है। Rx3: GFP अभिव्यक्ति के उच्च रिज़ॉल्यूशन समय अंतराल इमेजिंग, इसलिए, हमें समय के माध्यम से एकल आंख क्षेत्र को ट्रैक करने की अनुमति देता है क्योंकि यह रेटिना 17,18,20 में विकसित होता है।
ज़ेब्राफ़िश विकास के समय-अंतराल इमेजिंग अध्ययन मुख्य रूप से कॉन्फोकल या लाइटशीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके किए गए हैं। Confocal माइक्रोस्कोपी में लाभप्रद है कि यह z-अक्ष के साथ नमूनों की सटीक इमेजिंग के लिए अनुमति देता है और फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि संकेत को कम करता है। हालांकि, यह एक छवि, नमूना स्थिति कठोरता प्राप्त करने में लगने वाले समय की मात्रा, और लाइव नमूनों की फोटोब्लीचिंग और फोटोटॉक्सिसिटी की ओर इसकी प्रवृत्ति से सीमित है। लाइटशीट माइक्रोस्कोपी फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए मोटे नमूनों में प्रवेश करने की क्षमता, नमूना अभिविन्यास में लचीलापन में वृद्धि, कम से कम फोटोब्लीचिंग और फोटोटॉक्सिसिटी, और उच्च गति से इमेजिंग 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 के लिए मोटी नमूनों में प्रवेश करने की क्षमता के कारण समय के साथ ओकुलर मॉर्फोजेनेसिस की छवि बनाने का एक आदर्श तरीका है ,31। वर्तमान प्रकाश शीट माइक्रोकॉपी सिस्टम के साथ प्राप्त स्थानिक रिज़ॉल्यूशन लगभग 250-500 नैनोमीटर (एनएम) है। यद्यपि यह कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ प्राप्त की जा सकने वाली चीजों से काफी अलग नहीं है, नमूने को स्वतंत्र रूप से घुमाया जा सकता है और कई कोणों से चित्रित किया जा सकता है, जिससे इमेजिंग गहराई और रिज़ॉल्यूशन दोनों में सुधार होता है, और कॉन्फोकल प्लेटफ़ॉर्म27,32 की तुलना में विवो टाइम लैप्स इमेजिंग प्रयोगों के लिए बहुत अधिक लचीलापन प्रदान किया जा सकता है। . इन कारणों से, लाइटशीट माइक्रोस्कोपी जल्दी से ज़ेबराफ़िश विकास के समय-अंतराल इमेजिंग अध्ययनों के लिए पसंदीदा विधि बन रही है। यह प्रोटोकॉल Rx3: GFP ट्रांसजेनिक ज़ेब्राफ़िश की इमेजिंग के माध्यम से oculogenesis को परिमाणित करने के चरणों का वर्णन करता है जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लाइटशीट माइक्रोस्कोप33 का उपयोग करता है और एरिविस सॉफ़्टवेयर प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करके छवि विश्लेषण के लिए एक पाइपलाइन का विवरण देता है।
इस प्रोटोकॉल में, लाइटशीट माइक्रोस्कोप का उपयोग आंखों के विकास के समय-अंतराल इमेजिंग को करने के लिए किया गया था और परिणामस्वरूप डेटा का विश्लेषण किया गया था। परिणामी डेटासेट ओकुलर मॉर्फोजेनेसिस की प्रक्रिया में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है, साथ ही आनुवंशिक उत्परिवर्तन, औषधीय एजेंटों के संपर्क में आने या अन्य प्रयोगात्मक मापदंडों के परिणामस्वरूप इस प्रक्रिया के लिए परेशान करता है। यहां प्रोटोकॉल ने प्रदर्शित किया कि इस डेटासेट को कैसे प्राप्त किया जा सकता है और प्रारंभिक विकास के माध्यम से आंखों के क्षेत्र की मात्रा का विश्लेषण करने के तरीके का एक उदाहरण प्रदान किया गया है। इस डेटा को जैविक प्रतिकृतियों में पुनरुत्पादक और सुसंगत (मात्रा में 10% से कम भिन्नता) पाया गया था, यह ध्यान में रखते हुए कि रन की शुरुआत से पहले भ्रूण स्टेजिंग में मामूली अंतर अंतिम मात्रा माप में कुछ भिन्नता का कारण बन सकता है।
केशिका में भ्रूण की प्रारंभिक स्थिति में और उद्देश्य के सामने एम्बेडेड भ्रूण की स्थिति में देखभाल की जानी चाहिए। अभिविन्यास भ्रूण को बढ़ने और उद्देश्य के दृष्टिकोण से बाहर जाने से रोकने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। भ्रूण में 10 एचपीएफ पर एक गोल आकार होता है, जो केशिका में एक विशिष्ट अभिविन्यास की गारंटी देने के लिए चुनौतीपूर्ण बनाता है। आदर्श रूप से, भ्रूण के शरीर को केशिका में पार्श्व रूप से तैनात किया जाएगा। केशिका में कई भ्रूण लोड करने से एक अच्छी तरह से स्थित भ्रूण होने की संभावना बढ़ जाएगी।
इस प्रक्रिया में, भ्रूण को इमेजिंग और रोशनी के उद्देश्यों के सामने निलंबित करने के लिए एगारोज़ में एम्बेडेड किया जाता है। कम पिघलने के तापमान agarose की सही एकाग्रता का चयन महत्वपूर्ण है. एक एकाग्रता का बहुत अधिक भ्रूण को संकुचित करेगा और इसे ठीक से विकसित होने से रोकेगा; एक एकाग्रता के बहुत कम agarose अलग गिरने और भ्रूण पकड़ में परिणाम होगा. इस प्रोटोकॉल के लिए एकाग्रता इष्टतम 1% कम पिघलने के तापमान agarose30,31 की एक अंतिम एकाग्रता है।
एक और तत्व जिसे ध्यान में रखा जाना चाहिए वह संतृप्ति का स्तर है। जैसे-जैसे आईफील्ड बढ़ता है और अंतर करता है, Rx3: GFP सिग्नल की ताकत तेज हो जाती है। इसलिए, प्रारंभिक इमेजिंग पैरामीटर सेट करते समय, छवि को कम करने के लिए एक्सपोज़र और लेजर पावर को कम किया जाना चाहिए। यह छवि को ओवरसैचुरेटेड होने से रोक देगा क्योंकि Rx3: GFP समय के साथ उज्ज्वल हो जाता है। छवि प्रसंस्करण में undersaturation के लिए सही करने के लिए संशोधन किए जा सकते हैं, लेकिन छवियों का अधिग्रहण किया गया है के बाद oversaturation सही नहीं किया जा सकता है।
कुछ अतिरिक्त संशोधन हैं जो इस प्रोटोकॉल में किए जा सकते हैं जो कुछ परियोजनाओं के लिए फायदेमंद हो सकते हैं जो इस पेपर में वर्णित नहीं हैं। उदाहरण के लिए, छवि अधिग्रहण सेट अप में मल्टीव्यू इमेजिंग सेट अप करना संभव है। यह पैरामीटर y-अक्ष के साथ विभिन्न पदों पर कई भ्रूणों को प्रत्येक समय अंतराल पर क्रमिक रूप से चित्रित करने की अनुमति देगा। डेटा सेट में जटिलता जोड़ते समय, यह डेटा संग्रह की दर को बढ़ाएगा। इसके अतिरिक्त, छवि प्रसंस्करण के संदर्भ में, अन्य मापदंडों द्वारा आंख क्षेत्र को मापना संभव है। यहां, हमने बताया कि आंख क्षेत्र की मात्रा के संदर्भ में डेटा को कैसे निर्धारित किया जाए। वैकल्पिक रूप से, अलग-अलग कोशिकाओं को मापने और ट्रैक करने या ऑप्टिक पुटिका विलोपन की दर निर्धारित करने के लिए एक पाइपलाइन बनाई जा सकती है।
जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, दोनों confocal और Lightsheet माइक्रोस्कोपी zebrafish के समय-चूक इमेजिंग अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। लाइटशीट को विशेष रूप से इस परियोजना के लिए चुना गया था क्योंकि एक मोटी (>1 मिमी) नमूने के माध्यम से छवि की बेहतर क्षमता के कारण, क्योंकि यह ज़ेब्राफ़िश भ्रूण के लिए एक आदर्श तापमान वातावरण बनाए रखने के लिए एक इनक्यूबेशन इकाई से सुसज्जित है, और क्योंकि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की तुलना में तेज दर पर छवि बनाने की इसकी क्षमता इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक कई समय अंतराल पर छवि अधिग्रहण के लिए अनुमति देती है, भ्रूण21 के साथ कोई नुकसान या फोटोब्लीचिंग नहीं है, 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि लाइटशीट माइक्रोस्कोप कई फ्लोरोफोर से सिग्नल को प्रतिबिंबित करने के लिए सुसज्जित है। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले लाइटशीट माइक्रोस्कोप में 405, 445, 488, 515, 561 और 638 एनएम पर ठोस राज्य लेजर उत्तेजना रेखाएं हैं, जो एक से अधिक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर ट्रांसजीन को व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक भ्रूण की इमेजिंग के लिए उपयोगी हो सकती हैं।
जबकि यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से Lightsheet Z.1 दोहरी रोशनी माइक्रोस्कोप सिस्टम और एरिविस Vision4D विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके छवि अधिग्रहण विश्लेषण के लिए निर्देशों का विवरण देता है, Leica, Olympus, और Luxendo द्वारा बनाए गए अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Lightsheet माइक्रोस्कोप हैं, साथ ही Imaris द्वारा छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर, जिसका उपयोग समान परिणाम प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के लिए उपकरण और सॉफ्टवेयर का चयन हमारे संस्थान में उपलब्धता द्वारा निर्धारित किया गया था।
संक्षेप में, यह अनुमान लगाया जाता है कि यह प्रोटोकॉल लाइटशीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके टाइम-लैप्स इमेजिंग के संचालन के लिए एक ठोस प्रारंभिक बिंदु प्रदान करेगा, और ज़ेबराफ़िश में शुरुआती आंखों के विकास की छवि परिमाणीकरण के लिए।
The authors have nothing to disclose.
इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए शोध को पुरस्कार संख्या S10OD020067 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) के निदेशक के कार्यालय द्वारा और NIH पुरस्कार R01EY021769 (A.C.M. के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था। हम केंटकी विश्वविद्यालय में कला और विज्ञान इमेजिंग सेंटर में डौग हैरिसन और जिम बेगले की सहायता के लिए आभारी हैं, और विशेषज्ञ ज़ेबराफ़िश देखभाल के लिए लुकास विएरा फ्रांसिस्को और एवलिन एम टर्नबॉघ के लिए।
60mL Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309653 |
Agarose, Low Melting Temperature | Promega | V2111 |
arivis Vision4D Software | arivis | https://www.arivis.com/en/imaging-science/arivis-vision4d |
Dumoxel N3C Forceps | Dumont | 0203-N3C-PO |
E3 fish buffer (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4) | ||
Glass Capillary – Size 2 (~1mm) | Zeiss | Black/701904 |
Heidelberger Extension Line 100cm | B. Braun | 4097262 |
Light & Filter Set – Royal Blue | Night Sea | SFA-LFS-RB |
Petri Dish (100 x 15 mm) | VWR | 25384-302 |
Stereomicroscope Fluorescence Adapter | NightSea | |
Teflon Tipped Plunger – Size 2 | Zeiss | #701997 |
Tg(rx3:GFP) zebrafish | This line was established by Rembold et al.13 | |
Tricaine (MS222) | Sigma | A-5040 |
Z.1 Lightsheet | Zeiss | |
Zen Software | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |